El bloqueo de tipo salvaje PCR Combinado con la secuenciación directa como un método altamente sensible para la detección de baja frecuencia mutaciones somáticas
Summary
Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.
Abstract
La detección precisa y la identificación de mutaciones de baja frecuencia puede ser problemático cuando la evaluación de la enfermedad residual después de la terapia, la detección de mutaciones de resistencia emergentes durante el tratamiento, o cuando los pacientes tienen pocas células tumorales circulantes. el bloqueo de PCR de tipo salvaje seguido de análisis de secuenciación ofrece alta sensibilidad, flexibilidad y simplicidad como metodología para la detección de estas mutaciones de baja frecuencia. Mediante la adición de un diseño personalizado bloqueado oligonucleótido de ácido nucleico a un ensayo de secuenciación basado en la PCR convencional nuevos o previamente establecido, sensibilidades de aproximadamente 1 alelo mutante en un fondo de 1.000 alelos WT pueden lograrse (1: 1000). artefactos de secuenciación asociados con eventos de desaminación encuentran comúnmente en tejidos embebidos en parafina fijadas con formalina se puede remediar en parte por el uso de uracilo ADN glicosilasa durante los pasos de extracción. El protocolo optimizado aquí es específico para la detección de mutación MYD88, pero puede servir como una plantilla para diseñar cualquierensayo de WTB-PCR. Ventajas del ensayo WTB-PCR sobre otros ensayos comúnmente utilizados para la detección de mutaciones de baja frecuencia que incluyen PCR específica de alelo y PCR cuantitativa en tiempo real incluyen un menor número de ocurrencias de falsos positivos, mayor flexibilidad y facilidad de implementación, y la capacidad de detectar tanto conocidos y mutaciones desconocidas.
Introduction
secuenciación de Sanger ha sido tradicionalmente el estándar de oro en las pruebas de ambas mutaciones somáticas conocidos y desconocidos. Una de las limitaciones de secuenciación de Sanger es su límite de detección (~ 10 – 20% de alelo mutante en un fondo de WT) 1. Este nivel de sensibilidad es apropiado para la detección de mutaciones somáticas bajo nivel que pueden estar presentes en las muestras de los tejidos premalignos o pacientes con pocas células tumorales circulantes, o cuando la médula ósea (BM) es irregular. Esto también hace que la evaluación de la enfermedad residual después de la terapia o la detección de mutaciones de resistencia emergentes durante el tratamiento difícil por secuenciación convencional solo 2. Mediante la sustitución de PCR convencional con ácido nucleico bloqueado (LNA) mediada de tipo salvaje bloqueo de PCR (WTB-PCR) en la secuenciación de Sanger, sensibilidades de hasta 0,1% alelo mutante en un fondo de WT pueden lograrse 2, 3, 4. EnWTB-PCR, el enriquecimiento para los alelos mutantes se consigue mediante la adición de un corto (~ 10 – 14 NT) de bloqueo (LNA) oligonucleótido que se une preferentemente a ADN WT evitando de este modo la amplificación de ADN WT. El producto enriquecido WTB-PCR mutante puede ser entonces secuenciado. Mediante el bloqueo de DNA WT en lugar de seleccionar para mutaciones específicas WTB-PCR permite el enriquecimiento de ambas mutaciones conocidos y desconocidos presentes en fracciones de células minuto.
Múltiples métodos se utilizan actualmente para la detección de mutaciones en pequeñas fracciones células. Esto incluye PCR, el sistema específico de alelo de amplificación refractario a la mutación (ARMS), desnaturalización cromatografía líquida de alto rendimiento (DHPLC), cuentas, emulsiones, amplificación y magnetismo (BEAMing), la liberación inducida por el campo eléctrico y la medición (Efirm), de alta resolución punto de fusión y otros. Sin embargo, la mayoría de estos métodos están limitados por los falsos positivos y la capacidad de detectar sólo una mutación que el ensayo fue diseñado para 4 </sup>. WTB-PCR, sin embargo, permite al usuario visualizar las trazas de secuenciación que permite la detección de múltiples tipos de mutación y pueden ayudar en descartar falsos positivos debido a artefactos o eventos de desaminación. secuenciación de próxima generación (NGS) puede ofrecer una alternativa adecuada a la secuenciación convencional, sin embargo, sustancialmente mayores costos, la complejidad y tiempo de ensayo más largo hacen que sea una opción innecesaria para muchos tipos de enfermedades con pocos marcadores moleculares distintos o para la monitorización de pacientes en terapia para emergente mutaciones de resistencia. Además, las altas tasas de falsos positivos cuando la detección de variantes con frecuencias de los alelos mutantes de menos del 5% pueden plantear un problema para NGS a base de amplicón 5, 6.
Aquí se demuestra el incremento en la sensibilidad alcanzado por WTB-PCR en la detección de mutaciones en la diferenciación mieloide gen del factor 88 como se describe por Albitar et al. Mutatio 3 MYD88ns son importantes factores de diagnóstico y pronóstico en macroglobulinemia de Waldenstrom (WM), IgM gammapatía monoclonal de significado desconocido (IgM-GMSI), esplénica linfoma de la zona marginal (SMZL), y linfoma difuso de células B grandes (DLBCL). mutaciones MyD88 se encuentran en casi todos los casos de WM y aproximadamente el 50% de los pacientes con inmunoglobulina M (IgM) secretoras de GMSI. En contraste, las mutaciones MyD88 se encuentran en solamente 0-6% de los pacientes con SMZL y están ausentes en el mieloma múltiple 7, 8. Debido a la superposición morfológica, inmunofenotípicos, citogenéticas y las características clínicas entre WM y SMZL o mieloma IgM-múltiple a menudo puede complicar el diagnóstico diferencial, la presencia de una mutación MYD88 puede servir como un factor de identificación útil 9. MyD88 mutaciones también se han asociado con una mayor carga de la enfermedad en pacientes con DLBCL y la mala supervivencia global después de la terapia 7, </sup> 10. Además, debido a mutaciones MyD88 se encuentran con más frecuencia en DLBCL activado de células B-como (ABC) de centro germinal de células B-como (GCB) DLBCL o linfoma mediastínico de células B primario (PMBL), estado de la mutación MYD88 puede servir como una marcador sustituto para el subtipo ABC 11, 12.
El protocolo detallada proporcionada aquí sirve como una plantilla a partir de la que los nuevos ensayos pueden ser desarrolladas o la mayoría de los ensayos de secuenciación existentes se pueden adaptar fácilmente para detectar con precisión mutaciones de baja frecuencia en varios tipos de muestras. El enfoque también se puede utilizar para el seguimiento y la detección de mutaciones resistentes que se pueden desarrollar en tumores o incluso las bacterias que se pueden desarrollar mientras que los pacientes están siendo tratados con terapia dirigida o antibióticos. Además, que aborda y remedios muchos de los problemas asociados con el enriquecimiento de mutación, en particular en tejido embebido en parafina fijado con formalina (FFPE).
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo WTB-PCR descrito aquí utiliza un conjunto genérico de cebadores con un oligo de bloqueo diseñado para bloquear la amplificación de ADN durante la extensión WT (Figura 1). El producto WTB-PCR se secuencia a continuación para el análisis mutacional. La utilidad de WTB-PCR / Sanger radica en su simplicidad, de alta sensibilidad, y de alto rendimiento. Usando las directrices que se describen aquí, la mayoría de los ensayos basados en Sanger existentes pueden ser simplemente modifica…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| 1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul) | Roche | 12032937001 | With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1000 µl | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1000 µl | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~1000 ml | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
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