Summary

Produktion och administrering av terapeutiska mesenkymala stam / Stromacells- (MSC) sfäroiderna Primed i 3-D kulturer Under Xeno fria förhållanden

Published: March 18, 2017
doi:

Summary

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or ‘spheroids’ of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Abstract

Mesenkymala stamceller / stromaceller (MSC) är mycket lovande i bioteknik och regenerativ medicin. MSCs kan isoleras från flera vuxna vävnader via deras goda vidhäftning till vävnadsodlingsplast och sedan vidare expanderas in vitro, oftast med användning av fetalt bovint serum (FBS). Eftersom FBS kan orsaka MSCs att bli immunogena, dess närvaro i MSC kulturer begränsar både kliniska och experimentella tillämpningar av cellerna. Därför studier arbetskraft i kemiskt definierade xeno-fria (XF) media för MSC kulturer är mycket värdefulla. Många positiva effekter av MSC har tillskrivits deras förmåga att reglera inflammation och immunitet, främst genom utsöndring av immunmodulerande faktorer såsom tumörnekrosfaktor-stimulerad gen 6 (TSG6) och prostaglandin E2 (PGE2). Men MSC kräver aktivering för att producera dessa faktorer och eftersom effekten av MSC är ofta övergående, har stort intresse framkommit att upptäcka sätt att i förväg aktivera celler prior för att deras användning, vilket eliminerar fördröjningstiden för aktivering in vivo. Här presenterar vi protokoll för att på ett effektivt sätt aktivera eller prime MSCs i tredimensionella (3D) kulturer under kemiskt definierade XF förhållanden och att administrera dessa föraktiverade MSC in vivo. Specifikt vi först beskriva metoder för att generera sfäriska MSC mikro vävnader eller "sfäroider" i hängande droppar med hjälp av XF medium och visa hur sfärerna och konditionerat medium (CM) kan skördas för olika applikationer. För det andra, beskriver vi genuttryck skärmar och in vitro funktionella analyser för att snabbt bedöma graden av MSC aktivering i sfäroider, betonar den antiinflammatoriska och anticancer potential hos cellerna. För det tredje beskriver vi en ny metod för att injicera intakta MSC sfäroider i musen peritonealhålan för in vivo effektivitetstestning. Sammantaget protokollen häri övervinna stora utmaningar att få föraktiverade MSCs under kemiskt definierade XF conförhållanden och ger ett flexibelt system för att administrera MSC sfäroider för terapier.

Introduction

Mesenkymala stamceller / stromaceller (MSC) har visat stor potential för olika regenerativ medicin metoder. MSC ursprungligen isolerades som en stromal komponent i benmärgen, men har sedan dess erhållits från många andra vuxna vävnader, inklusive fettvävnad en, två, tre. Intressant nog omfattar huvudisoleringsmetoden den anmärkningsvärda egenskapen hos MSCs att vidhäfta stadigt på vävnadsodlingsplast i närvaro av fetalt bovint serum (FBS). Även om detta traditionella isoleringsteknik medger enkel och snabb expansion av MSC i tvådimensionell (2D) kultur, är det också mycket artificiell och bortser betydelsen av nativa tredimensionella (3D) miljö som leder till potentiell förlust av viktiga cellegenskaper 4, 5 , 6. Därför studiet av MSCs i 3D-kulturer, somär mer fysiologiska än traditionella 2D kulturer, har dykt upp i sökandet efter "förlorade / minskade" MSC egenskaper. Dessutom har ett stort intresse ökat för att identifiera Xeno Fritt (XF) kemiskt definierade villkor för MSC kultur och aktivering, och därmed göra cellerna mer mottagliga för kliniska tillämpningar.

Många studier har publicerats som visar 3D-kulturen i MSC både i biomaterial och som sfäriska aggregat eller sfäroider. MSC i biomaterial ursprungligen avsedd för vävnadstekniska metoder för att ersätta skadade vävnader med cell seedade ställningar, medan sfäroida kulturer av MSC sågs som ett sätt att förstå MSC beteende in vivo efter administrering av cellerna för behandlingar i prekliniska och kliniska prövningar 4, 5, 7. Intressant MSC bildar sfäroider spontant när vidhäftning till vävnadsodlingsplast är inte tillåtet8, 9, 10. Traditionellt har cell aggregering underlättas genom spinnerflaska metoder eller flytande tekniker overlay, metoder som används initialt i cancerbiologi i arbetet med att försöka efterlikna tumörmikromiljö. På senare tid har ytterligare metoder dykt upp som visar cell aggregering i odlingsskålar i förväg belagd med specifika kemikalier för att förhindra cell-till-plast vidhäftning 4, 5, 6. Ett av de enklaste och mest ekonomiska metoder för att generera MSC sfäroider är att odla dem i hängande droppar, en teknik som ofta användes för att producera embryoidkroppar från embryonala stamceller. Med hängande droppe odlingstekniken, är cellvidhäftning till vävnadsodlingsplast förhindras genom att suspendera cellerna i en droppe medium på undersidan av en vävnadsodlingsskål lock och låta tyngdkraften för att underlätta cell aggregation i apex av droppen. Sfäroiddiametern storlek kan lätt manipuleras genom att ändra cellkoncentrationen eller den droppvolymen, vilket gör hängande droppe kulturer speciellt lätt att kontrollera.

Tidiga studier på 3D kultur MSC visade radikala skillnader i egenskaper hos cellerna i 3D jämfört med sina 2D motsvarigheter 6, 8, 9. Samtidigt, rapporter visat att de gynnsamma effekterna av MSC: er in vivo förlitat sig på deras förmåga att bli aktiverad av mikromiljö signaler och som svar, för att producera anti-inflammatoriska och immunmodulerande faktorer 11. Intressant nog många av dessa faktorer såsom prostaglandin E2 (PGE2), tumörnekrosfaktor-stimulerad gen 6 (TSG6), och hepatocyte growth factor (HGF) producerades i mycket större mängder av MSC spheroids än traditionella 2D MSC banar väg för idé ommed hjälp av 3D-kulturer för att aktivera cellerna 8, 12, 13. Dessutom genaktivering i 3D-kulturer tycktes rekapitulera mekanismer, åtminstone delvis, av cellaktivering efter injektion i möss 12. Genom att aktivera MSCs innan deras användning i experiment, kan effekterna av cellerna förlängas och mer framträdande som den traditionella MSC effekt in vivo är ofta försenade och övergående, och kan beskrivas som "hit and run". Under de senaste åren har viktiga funktionella studier med användning av MSC sfäroider visat att de kan undertrycka inflammatoriska reaktioner och modulera immunitet in vivo genom att påverka effektorceller såsom makrofager, dendritiska celler, neutrofiler och T-celler gör sfäroider en attraktiv form av primade MSC 2 , 3. Dessutom produktion av anti-cancermolekyler, såsom interleukin-24 (IL-24) och tumömekrosfaktor-relaterad apoptosinducerande ligand (TRAIL), ökar i 3D-kulturer av MSCs i förhållande till monoskiktet MSC: er, ett fenomen som skulle kunna utnyttjas för riktade cancerterapier 8, 10, 14.

Som den traditionella MSC kultur krävs inte bara användningen av vävnadsodling plast men också FBS till en annan hinder gör MSC sfäroider mer mottaglig för klinisk användning hade övervinnas. Att ta itu med detta hinder, vi nyligen visade bildandet av MSC sfäroider under specifika kemiskt definierade XF förhållanden och konstaterat att de resulterande MSC sfäroiderna aktiverades för att producera samma anti-inflammatoriska och anti-cancermolekyler som sfäroiderna genereras under förhållanden med FBS 14. Här är dessa resultat presenteras i flera detaljerade protokoll som visar genereringen av föraktiverade MSCs i 3D kulturer använder XFmedia. Dessutom är protokoll presenteras som beskriver effektiva sätt att bedöma aktiverings nivåer av MSCs i avseende på deras anti-inflammatoriska, immunmodulerande och anti-cancer effekter, tillsammans med en praktisk metod för att leverera intakta sfäroiderna i möss.

Protocol

1. MSC Isolering och Expansion Skaffa tidig passage MSCs från center för framställning och distribution av vuxna stamceller ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html~~number=plural ) 15 som frysta flaskor. Alternativt, isolera MSC från benmärgsaspirat efter en rutin protokoll 14 och lagra frysta flaskor. Förbereda komplett odlingsmedium (CCM), som är …

Representative Results

I det pågående arbetet, hängande droppe kulturer används för att generera kompakta sfäriska mikro vävnader eller "sfäroider" av aktiverade MSCs enligt XF förhållanden. Prövnings färdplan i Figur 1 visar att MSC uppmuntras att själv montera in spheroids när de suspenderas i hängande droppar under 72 timmar, varefter sfäroiderna eller CM laddad med sfär framställda terapeutiska faktorer kan samlas in och potentiellt utnyttjas i både forskning o…

Discussion

Den optimala MSC för användning i vissa forskning och kliniska tillämpningar bör vara mycket aktivt för att maximera sin fördel, och företrädesvis framställts under kemiskt definierade XF villkor för att minimera leverans av potentiella antigener från xenogena mediumkomponenter såsom FBS. I protokollen som beskrivs här, har vi visat metoder för att 1) ​​aktivera MSC i 3D-kulturen genom bildning av sfäroider, 2) uppnå 3D aktiveringen av MSCs i XF förhållanden, 3) utvärdera aktiveringsnivåer sfäro…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.

Materials

MEM-α (minimal essential medium alpha) ThermoFisher/Gibco 12561049; 12561056; 12561072 minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select Atlanta Biologicals S11595; S11510; S11550; S11595-24 component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine ThermoFisher/Gibco 25030081; 25030149; 25030164 component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher/Gibco 15070063 component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane MilliporeSigma SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE media sterilization
150 mm cell culture dish Nunc D8554 SIGMA cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator Thermo Fisher Model 3110 incubation of cultured cells
Early passage MCSs Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White NA preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath VWR 89501-468 warming media to 37 °C
Pipettes Eppendorf 492000904 manual liquid handling
Pipete-Aid Drummond Scientific Company 4-000-300 handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) Corning 4487; 4101; 4251; 4490 liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 ThermoFisher/Gibco 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution ThermoFisher/Gibco 25200056; 25200072; 25200114 lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube Corning/BD Falcon 352097 cell centrifugation
50 ml conical tube Corning/BD Falcon 352098 cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge Eppendorf/Fisher Scientific Model 5810R cell centrifugation
hemocytometer Fisher Scientific 26716 cell counting
trypan blue Sigma-Aldrich T8154 SIGMA dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) ThermoFisher/Gibco A1067501 Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) Stem Cell Technologies 5420 Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin) Gemini 800-120 Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin) Sigma-Aldrich A9731 SIGMA Component of xeno-free MSC media
8-channel pipette, 10 – 100 µL Eppendorf 022453904 preparation of hanging drops
Total RNA isolation Mini Kit Qiagen 74104 Total RNA extraction
Qiashredder Qiagen 79654 Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set  Qiagen 79254 On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 ALDRICH inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex VWR 97043-562 mixing sample
Spectrophotometer Biorad NA RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit ThermoFisher/Applied Biosystems 4368814 transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays ThermoFisher/Applied Biosystems varies primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix ThermoFisher/Applied Biosystems 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) ABI Prizm NA real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube Eppendorf 22364111 cell centrifugation, sample collection and storage
(-80°C) freezer Thermo Fisher Model Thermo Forma 8695 sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit R&D Systems KGE004B estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) ThermoFisher/Gibco 10566-016; 10566-024;10566-032 macrophage culture media
J774 mouse macrophages ATCC TIB-67 mouse macrophage cell line
12-well plate Corning 3513 in-vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide) Sigma-aldrich L4130 in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit R&D Systems MTA00B estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit R&D Systems M1000B estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium ThermoFisher/Gibco 11875-085 splenocyte culture media
BALB/c mice The Jackson Laboratory 651 in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified eBioscience 145-2C11 In vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer  Corning 352350 Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x) Affymetrix eBioscience 00-4333 removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-y (interferon gamma) ELISA kit R&D Systems MIF 00 estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells  ATCC CRL-1740 study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit ThermoFisher C7026 cell number measurement based on DNA content
NaCl Sigma-Aldrich S5150 component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) ThermoFisher FERR1021 calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A Qiagen 19101 RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader BMG Technology NA Microplate assays (ELISA, cell quantification, e.t.c.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher/Gibco 14175079 resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane MWI Vet Supply 502017 Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas Praxair NA For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet Thermo Fisher Model 1385 Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20G, 1 inch Terumo SR*FNP2025 Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips Eppendorf varies liquid/cells handling

References

  1. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: New directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  2. English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560 (2013).
  3. Le Blanc, K., Mougiakakos, D. Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system. Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).
  4. Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture. Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).
  5. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 9176357 (2016).
  6. Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).
  7. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).
  8. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  9. Potapova, I. A., et al. Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  10. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
  11. Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
  12. Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1). Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).
  13. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype. Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).
  14. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions. Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).
  15. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  16. Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  17. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  18. Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells’ Paracrine Immunomodulatory Effects. Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).
  19. Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).
  20. Prockop, D. J. Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation. Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).
  21. Krampera, M. Mesenchymal stromal cell ‘licensing’: a multistep process. Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).
  22. Saleh, F. A., Genever, P. G. Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution?. Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).
  23. Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
  24. Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
  25. Lee, E. J., et al. Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction. Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).

Play Video

Cite This Article
Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Mohammadipoor, A., Bartosh, T. J. Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions. J. Vis. Exp. (121), e55126, doi:10.3791/55126 (2017).

View Video