Analyse von Cap-bindende Proteine ​​in menschlichen Zellen zu Physiologische Sauerstoffbedingungen ausgesetzt

Translational Steuerung zeichnet sich als ein ebenso wichtiger Schritt , um die Transkriptionsregulation in der Genexpression, insbesondere in Zeiten der zellulären Stress ^1. Ein Schwerpunkt der Translationskontrolle ist bei der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Einleitung , wo die ersten Schritte der Proteinsynthese , die Bindung des eukaryotische Initiationsfaktor 4E (eIF4E) an die 7-Methylguanosin (m ⁷ GTP) 5' – Cap von mRNAs beinhalten ² . eIF4E ist Teil eines trimeren Komplex namens eIF4F die eIF4A, eine RNA – Helikase und eIF4G, ein Gerüstprotein , die für die Rekrutierung anderer Übersetzungsfaktoren und die 40S – Ribosoms ³ umfasst. Unter normalen physiologischen Bedingungen, die überwiegende Mehrheit der mRNAs über einen CAP-abhängigen Mechanismus übersetzt, aber unter Perioden der zellulären Stress etwa 10% der humanen mRNAs enthalten 5 'UTR , die cap-unabhängige Translation Initiation ^1,4 ermöglichen kann. Cap-abhängige Translation ist historisch Synonymous mit eIF4F jedoch stressspezifische Varianten von eIF4F haben ein Trend – Thema geworden ^5-8.

Verschiedene Zellspannungen verursachen eIF4E Aktivität über die Säugetier-Ziel von Rapamycin-Komplex 1 (mTORC1) verdrängt werden. Diese Kinase wird unter Stress beeinträchtigt, die eines seiner Ziele in der erhöhten Aktivität führt, die 4E-Bindungsprotein (4E-BP). Nicht-phosphoryliert 4E-BP bindet an eIF4E und blockiert ihre Fähigkeit , mit eIF4G wodurch die Unterdrückung von Cap-abhängige Translation ^9,10 zu interagieren. Interessanterweise hat ein Homolog von eIF4E namens eIF4E2 (oder 4EHP) eine viel geringere Affinität für 4E-BP ^11, vielleicht so dass es Stress-vermittelten Repression zu entziehen. Tatsächlich zunächst als Repressor der Übersetzung charakterisiert aufgrund seiner mangelnden Wechselwirkung mit eIF4G ¹² initiiert eIF4E2 Übersetzung von Hunderten von mRNAs , die RNA Hypoxie – Response – Elemente in ihren 3' – UTR ^6,13 während des hypoxischen Stress enthalten. Diese Aktivierung is durch Wechselwirkungen mit eIF4G3 erzielte RNA – Bindungsprotein – Motiv 4 und der Hypoxie – induzierbaren Faktor (HIF) 2α einen hypoxischen eIF4F Komplex oder eIF4F ^{H 6,13} zu bilden. Als Repressor unter normalen Bedingungen bindet eIF4E2 mit GIGYF2 und ZNF598 ^14. Diese Komplexe wurden, teilweise identifiziert durch Agarose-linked m ⁷ GTP Affinitätsharze. Diese klassische Methode ¹⁵ ist im Bereich der Übersetzungsnorm und ist die beste und am häufigsten verwendete Technik cap-Bindungskomplexe in Zug zu isolieren , nach unten und in – vitro – Bindungsassays ^16-19. Da der cap-abhängigen Translationsmaschinerie als flexibel und anpassungsfähig mit inter ändernden Teilen Schwellen ^6-8,13 Dieses Verfahren ist ein leistungsfähiges Werkzeug , um schnell neue cap-Bindungsproteine in der Stressantwort beteiligt identifizieren. Weiterhin ist in Variationen eIF4F könnte weitreichende Auswirkungen haben, da mehrere eukaryotische Modellsysteme scheinen eine eIF4E2 Homolog für Stressreaktionen zu verwenden, wiewie A. thaliana ^20, S. Pombe ^21, D. melanogaster ²² und C. elegans ^23.

Hinweise darauf , dass Variationen in eIF4F nicht streng auf Stressbedingungen beschränkt, sondern in der normalen Physiologie ²⁴ einbezogen werden. Die Sauerstoffversorgung der Gewebe (in Kapillarenden) oder innerhalb von Geweben (via Mikroelektroden gemessen wird ) variiert von 2-6% im Gehirn ^25, 3-12% der Lunge ^26, 3,5-6% im Darm ^27, 4% in die Leber ^28, 7-12% in der Niere ^29, 4% in Muskel ³⁰ und 6-7% in dem Knochenmark ^31. Zellen und Mitochondrien enthalten weniger als 1,3% Sauerstoff ^32. Diese Werte sind sehr viel näher an Hypoxie als die Umgebungsluft, wo Zellen routinemßig kultiviert. Dies legt nahe, dass das, was vorher waren gedacht als Hypoxie-spezifische zelluläre Prozesse in einer physiologischen Umgebung von Bedeutung sein können. Interessanterweise eIF4F und eIF4F ^H </sup> aktiv an der Translationsinitiations verschiedener Pools oder Klassen von mRNAs in verschiedenen menschlichen Zelllinien teilnehmen zu physiologischen Sauerstoff ausgesetzt oder "physioxia" ^24. Niedrige Sauerstoff treibt auch die richtige Entwicklung des Fötus ³³ und Zellen haben in der Regel höhere Proliferationsraten, längere Lebensdauer, weniger DNA – Schäden und weniger allgemeine Stressreaktionen in physioxia ^34. Daher ist eIF4F ^H wahrscheinlich ein wichtiger Faktor bei der Expression von ausgewählten Genen unter physiologischen Bedingungen.

Hier bieten wir ein Protokoll zur Kultivierung von Zellen in festen physiologischen Sauerstoffbedingungen oder in einem dynamischen Schwankungsbereich, die wahrscheinlich mehr repräsentativ für Gewebe-Mikroumgebungen ist. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass Zellen innerhalb der Hypoxie Workstation lysiert werden. Es ist oft nicht klar, wie der Übergang von hypoxische Zellkultur zu Zellaufschluß wird in anderen Protokollen durchgeführt. Zellen werden oft zunächst von einem kleinen Hypoxie Inkubator entfernt werdenVordergrund – Lyse, aber diese Exposition gegenüber Sauerstoff konnte biochemische Wege beeinflussen , wie die zelluläre Reaktion auf Sauerstoff schnell ist (ein oder zwei Minuten) ^35. Bestimmte cap-bindende Proteine erfordern Wechselwirkungen mit einer zweiten Base oder die m ⁷ GTP hydrolysieren daher einige Kappe Interaktoren können in dem Reinigungsverfahren fehlen. Agarose-gebundenen enzymatisch sicheren Verschluss-Analoga können in diesem Protokoll ersetzt werden. Erforschung der Aktivität und Zusammensetzung der eIF4F ^H und andere Variationen von eIF4F durch das hier beschriebene Verfahren wird Licht auf die komplizierten Genexpression Maschinerien , die Zellen während der physiologischen Bedingungen oder Stressreaktionen zu nutzen.