بروتين طريقة التحضير لتحديد إنتاجية عالية من البروتينات التفاعل مع العامل المساعد النووية عن طريق LC-MS / MS تحليل
Summary
لقد وضعنا طريقة لتنقية البروتينات التفاعل coregulatory باستخدام نظام LC-MS / MS.
Abstract
Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.
Introduction
تفاعلات البروتين البروتين تلعب دورا هاما في العديد من الوظائف البيولوجية. على هذا النحو، قد تورطت هذه التفاعلات في نقل الإشارة. نقل البروتين عبر أغشية الخلايا. استقلاب الخلية. والعديد من العمليات النووية، بما في ذلك تكرار الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي من التلف والتوحد، والنسخ 1، 2، 3، 4. تحديد البروتينات المشاركة في هذه التفاعلات لذا فمن الأهمية بمكان تعزيز فهمنا لهذه العمليات الخلوية.
مناعي (IP) هو أسلوب التحقق من صحة استخدامها لتحليل التفاعلات البروتين البروتين. من أجل تسهيل التعرف على البروتينات immunoprecipitated المشترك، وغالبا ما يستخدم قياس الطيف الكتلي 5، 6، 7، 8،9. من خلال استهداف عضوا معروفا في مجمع البروتين مع الأجسام المضادة، فمن الممكن لعزل بروتين معقد وتحديد وقت لاحق مكوناته غير معروفة عن طريق تحليل الطيف الكتلي. ARIP4 (الاندروجين-التفاعل مستقبلات البروتين 4)، وcoregulator النسخي، يتفاعل مع البروتينات المستقبلة النووية من أجل تنشيط أو قمع المروجين هدفه بطريقة تعتمد على السياق 9 و 10. من أجل فهم أفضل الآليات التنظيمية النسخي التي تحكم هذه العوامل النووية، وصفنا أسلوبا شاملا لتنقية وتحديد ARIP4 البروتينات التفاعل باستخدام نظام LC-MS / MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
ترنسفكأيشن كفاءة ضروري للحصول على نتيجة ناجحة مع هذا البروتوكول. وفقا لذلك، فإننا نوصي باستخدام تحليل لطخة غربية لتحديد مستويات البروتين FLAG الموسومة immunoprecipitated. هذه الخطوة تمكن المستخدمين من التحقق من أن البروتين اهتمامهم هى overexpressed بشكل صحيح، وعلاوة على ذلك، أن الم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), the Takeda Science Foundation (HT), and by a Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Young Scientists (B) to HT.
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) | nacalai tesque | 03969-21 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Micro Bio-Spin Columns | BIO-RAD | 732-6204 |
References
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807 (2010).
- Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
- MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
- Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
- Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
- Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
- Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
- Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430 (2013).
- ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics – the user’s guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
- Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
- Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498 (2015).
- Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
- Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
- Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D’Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
- Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).
