从外周血中分离和鉴定的微泡

所有的实验，包括人类受试者已批准由当地伦理委员会（批准文号14年3月2日）。对患者的选择应当注意的是，几个因素，如年龄，性别，当前治疗方案和许多可能影响血液的MV组合物，因此，应当考虑到事先考虑到样品采集22,23。 1.血浆样品的制备通过21号蝴蝶针到含有EDTA（1.6毫克/毫升血）一个真空采血管的血液收集管的每个供体血2管 – 绘制1。确保反转管（S）数次，以保证有效的抗凝血。 注意：血后续流式细胞仪和Western blot分析推荐量是5 – 15毫升。为了防止压退化和丧失，血样应采血后30分钟进行处理<。 离心15分钟将样品在1200 xg离心制备血浆样品室温（RT）。 为了从剩余的血细胞（=下层）帮助等离子体（=上层）的分离应用阀的过滤器。 等离子体转移到15毫升管中。 在1500 xg离心离心15分钟，室温以沉淀较大细胞碎片和除去残留的血小板。 将上清转移到15毫升管中并用中压分离或商店的样品直接进行在-20℃下长达6个月。 注意：所提出的协议，也可以用于分离从细胞培养物上清液的MV（和的Exos）。为了做到这一点，培养细胞在60％ – 80％汇合24 – 在培养基中48小时补充有囊泡贫FCS，然后回收上清。离心机在750 xg离心5分钟，4℃至耗尽残余漂浮细胞，再次填充上清液到新的15毫升管中并离心5分钟，在1500 xg离心，4℃以沉淀较大细胞碎片。然后该上清液可用于MV的隔离2.16 – 在2.1步骤描述。 2. MV的隔离在一个合适的离心管转移血浆样品。如果需要的话，为了在离心分离过程中稀释样品，并防止薄壁管的塌陷填充管，用PBS。 离心机在14000 xg离心，4℃35分钟。 倒出上清液，保持管颠倒了，把在纸巾上。等待3 – 5分钟，直到所有剩余的上清液已经浸透到毛巾，从而从样品中除去。 重悬在1000微升PBS中的MV沉淀，转移到1.5mL管中，并离心35分钟在14000 xg离心，4℃下在台式离心机。 吸上清。 重悬在50的MV粒料 – 500微升PBS中，取决于粒料的大小。备选地，裂解的MV直接， 例如 ，在RIPA缓冲液（150毫摩尔NaCl / 0.1％SDS / 0.5％的Na-脱氧胆酸盐/ 1％的Triton X-100 /的50mM Tris，pH7.2）中随后的免疫印迹分析。商店的MV在-20℃。他们将保持稳定数月，但要避免反复冻融周期。 可选的：为了评估MV产量或剂量对于随后的实验的MV确定与蛋白测定的MV蛋白质浓度（ 例如 ，布拉德福德或Lowry法）。 如果额外的Exos要从血浆样品中分离，滗析从步骤2.3上清液到超速离心管中，离心分离2小时在11万xg离心，4℃。如步骤2.3中所述倒出上清液，重悬外切粒料在1000微升PBS中，并转移到小（1.5mL）中超速离心管中。 超速离心2小时在11万xg离心，4℃，吸上清，重悬外切粒料在50 – 75微升PBS或RIPA缓冲液。 3.流式细胞仪MV的表征转移15微升PBS + 1％囊泡 – 贫胎牛血清（FCS）在流式细胞术管。 注：囊泡贫FCS由如先前24描述的（在56℃，30分钟）FCS的110000 XG通过0.2微米的过滤离心热灭活18小时，过滤上清液制备。 添加5微克（在低收率3微克也适用的情况下）在PBS中的MV。 孵育以阻断在压表面的非特异性的结合部位，从而减少背景染色在室温30分钟的样品。 添加荧光标记的抗体对蛋白质的感兴趣。滴定抗体的用于为了确定最佳的浓度，并保证一个低信号对噪声比使用前染色的量。确保也包括一个管与未染色的MV作为阴性对照，并在同一浓度与匹配的同种型对照抗体染色的（ 例如 ，如果使用抗体的1微克，也使用同种型对照的1微克MV的一个管tibody）量化背景染色。 注意：也可以通过增加耦合到不同的荧光染料多种抗体流式细胞执行多色流。 在室温下孵育在黑暗中20分钟。 添加250微升PBS中，并使用流式细胞仪的试样的测定进行。 万一该样品不能被立即测量，添加150μL的PBS中，并加入50μL4％低聚甲醛（PFA）在4℃下以固定的样品和存储。注意：PFA是有毒的。使用手套和适当的个人防护装备。 减少流动的阈血细胞计数到可能的最低值，并搜索使用前向散射（FSC）对对数尺度侧散射（SSC）情节的MV人口。门上的MV人口并评估在相应直方图中的荧光信号。 4.表征的MV由Western印迹直接悬浮颗粒MV中合适的裂解缓冲液（ 例如 ，RIPA缓冲液）。 在的情况下的MV粒料已经被重新悬浮在PBS中，稀释它至少1：1的在一个合适的裂解缓冲液（ 例如 ，RIPA缓冲液）。 确定的MV样品的蛋白质浓度， 例如，通过Lowry法。 准备10 – MV的20微克22.5微升RIPA缓冲。然后在95℃下添加7.5微升4倍的Laemmli负载缓冲液和热5分钟。 上的聚丙烯酰胺凝胶负载样品和根据标准方法进行电泳和免疫印迹。 蛋白质转移到膜后，根据标准方法进行丽春红染色作为上样对照。 在TBST脱色膜在RT 5分钟。 块膜用于在TBST的5％BSA的30分钟到1小时在室温。 在4℃下与第一抗体孵育膜过夜或在室温下2小时。 用TBST 3×5分钟洗膜。以1:1的稀释孵育与HRP偶联的二抗膜：在5 10,000％BSA中。注意：在高背景信号的情况下，使用奶粉代替BSA中。 洗用TBST 3×5分钟的膜。 与ECL检测试剂开发膜与化学发光膜或化学发光成像系统检测信号。 注意：为了区分从的Exos的MV，如微管蛋白的蛋白质，辅肌动蛋白-4或mitofilin可以使用哪些应主要存在于的MV 16,25。注意该用作的Exos标记最四旋抗体（ 例如，CD9，CD81），不减少的条件下工作，因此应在非还原加样缓冲液，然后加热10分钟在70℃来制备。