المجهر الضوئي ورقة الإسفار من جذور النباتات التي تنمو على سطح الأرض من هلام
Summary
This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.
Abstract
One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.
Introduction
واحدة من المسائل الرئيسية في تطوير المصنع الفهم هو كيف تتصرف الخلايا واحدة خلال التمايز الجهاز والنمو. من الناحية المثالية، الأحداث الخلوية، مثل أنماط التعبير الجيني والخلايا توطين البروتين، يمكن أن ينظر إليه في ضوء سياق أوسع من الأنسجة. هذا الهدف تحديات التقنية ويفرض رقابة الجهاز كله مع مكانية عالية وكذلك قرار الزمني على مدى فترات طويلة من الزمن، والتي قد تتسبب في آثار صور سمية. منذ النباتات التكيف بسرعة مع التغيرات البيئية، وظروف النمو يجب أن تخضع لرقابة مشددة. من أجل القيام التصوير على المدى الطويل دون التدخل في الحالة الفسيولوجية للنبات، وإلى أن تكفل ثلاثة أشياء الظروف، 1) نموا في حجرة العينة، 2) عينة مستقرة تصاعد على مدى فترات طويلة من الزمن، و 3) التصوير مع شدة الإضاءة المنخفضة لتجنب الصور الضرر وظروف غير الفسيولوجية.
الفسيولوجية conditi المتزايدالإضافات في غرفة المجهر العينة هي حاسمة لإجراء التجارب على المدى الطويل. وهناك عدد من البروتوكولات المتاحة التي تصف غرف النمو التصوير لالمجاهر مبائر 1-3. ومع ذلك، الفحص المجهري متحد البؤر يقدم عالية للضوء كثافة لهذا المصنع، الذي يمكن أن يسبب استجابات التوتر، وعادة ما يمنع نمو 4. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم المجاهر التقليدية تسمح المواقع الأفقي فقط من العينة، وهي ليست الأمثل لمحطات لأنها محاولة لإعادة توجيه أنفسهم والتطور نحو متجه الجاذبية. على مدى السنوات العشر الماضية، ظهرت للضوء ورقة المجهر كأداة قوية للقبض على تطوير نماذج كبيرة في قرار الخلوية لفترات زمنية تصل إلى عدة أيام 5-9. ورقة الخفيفة المجهري يسمح المواقع العينة عموديا، ويستخدم بشكل متزايد في البحوث النباتية دراسة التنمية الجذرية 10-21، استعرضت مؤخرا من قبل بيرتر وMaizel 22. العديد من الدراسات المذكورة 10،13 – 18،21 كانت الأمثل والتي أجريت في مختبر إرنست هونج كونج ستلزر توظيف بطريقة خاصة من عينة تصاعد تتميز نموا في الجذر على سطح هلام 17. في هذه الدراسات، تم استخدام المجهر حسب الطلب، والذي يقام المصنع من أسفل. في المقابل، فإن الغالبية العظمى من المجاهر الضوئية ورقة المتاحة على نطاق واسع الاستمرار على عينة من أعلى. وهكذا، وهذا الأسلوب إعداد خاص لا يمكن تطبيقها بسهولة. الطريقة المعروضة هنا يوفر بروتوكول لعلى سطح طريقة التركيب راسخة للتطبيق لOpenSPIM 23، وهي منصة مفتوحة المصدر لتطبيق وتعزيز الانتقائية طائرة الإضاءة المجهري (SPIM).
ويتمثل الهدف العام من هذا البروتوكول هو تمكين التصوير على المدى الطويل من جذور نبات الأرابيدوبسيس في OpenSPIM الخفيفة ورقة المجهر. ويتم إنجاز هذا من خلال زراعة نبات تستقيم على الصورةurface من هلام مع جذور في الوسط السائل في حين تظل الأوراق في الهواء. من أجل ضمان النشاط الضوئي للنبات، ونظام الإضاءة حسب الطلب ينير الأوراق ولكن ليس الجذور (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
ورقة الخفيفة الإسفار المجهري لديه ميزة كبيرة على الجمع بين انخفاض الضيائية وسرعة اكتساب فائق السرعة، والتي يمكن استخدامها لالتقاط حجم كبير مع ارتفاع القرار المكانية والزمانية مع الحفاظ على عينة في الحالة الفسيولوجية. حل المجهر ورقة خفيفة يمكن مقارنة بما كان عليه من المجهر متحد البؤر 9. ومع ذلك، تشتت الضوء وامتصاص يحدث على طول مسار الإثارة وانبعاث بشكل فردي وجودة الصورة الشاملة يمكن أن يكون أقل من ذلك بكثير داخل الأنسجة مبهمة مقارنة مع السطح. للتحايل على هذه المضاعفات يمكن للمرء أن استخدام إمكانية تدوير العينة على طول المحور الرأسي ونلاحظ نفس الحجم من اتجاهات مختلفة. ولكن هذا ليس دائما مفيدا، على سبيل المثال الجذور الجانبية تظهر على جانب واحد من الجذر والتصوير من وراء النتائج في جودة الصورة منخفضة دون الحصول على مزيد من المعلومات. ومع ذلك، فإن دوران يمكن أن تستخدم أساسا لوضع عصيدةلو في أفضل طريقة. الترتيب الأفقي الكلاسيكية من العدسات موضوعية يسمح عن سبل جديدة لعينة المتصاعدة. تستفيد النباتات من وضع عمودي. المقدمة هنا، فإن "على سطح الجل" طريقة التركيب ديها العديد من المزايا بالمقارنة مع الطرق تصاعد أخرى مثل تضمين الجذر داخل هلام 24،25. 1) نظام الجذر هو على اتصال مباشر مع الوسط السائل. توصيل حجرة العينة إلى نظام نضح الذي يوفر متوسطة جديدة باستمرار. ويمكن أن تستخدم أيضا لتبادل بسرعة وحدة التخزين بالكامل من غرفة عينة لتطبيق وسائل الإعلام أو أدوية مختلفة. 2) وقبل أخذ عينات النباتات إعداد تنمو كما أنها تستخدم لتنمو في المختبرات. النباتات يمكن اختيار تحت المجهر مضان وتحتاج إلى أن تكون مستعدة فقط النباتات المطلوبة. 3) يتم نقل المصنع من طبق بيتري لصاحب العينة دون لمسها. وبالتالي يمكن للمصنع مواصلة تطوير على نفس هلام انها تنمو على في incubato النمويتم تقليل ص والضغط الميكانيكي إلى أدنى حد ممكن. 4) وجهة النظر على عينة هو دون عائق ويتم الحد من الانحرافات البصرية لأنه يتم ملء الفضاء بين العينة والهدف كشف فقط مع المتوسطة وأية مواد أخرى مع اختلاف مؤشرات الانكسار.
من أجل أداء التصوير على المدى الطويل، من الضروري النظام مصنع إضاءة لضمان النشاط الضوئي للنبات. في معظم المختبرات تنمو النباتات على مادة هلامية شفافة، أي أن يتعرض لها جذور للضوء. وهذا قد يسبب ردود فعل متباينة تجاه بيئتهم ويؤدي الى تغييرات في الكيمياء الحيوية وتنميتها 26،27. من أجل تقليل كمية الضوء على نظام الجذر، وكان يستخدم رقائق البلاستيك الأسود لتغطية سطح المياه، فضلا عن غطاء مصنوع من رقائق الألومنيوم سوداء تغطي حجرة العينة. ضوء يمكن أن تصل إلى النبات الأوراق من خلال ثقب مركزي في الغطاء. في هذا الإعداد، لوحظ عدم وجود زيادة في ضوء الخلفية، suggestinز أن كمية الضوء الشارد من المصابيح الحمراء والزرقاء وخفضت بشكل كبير من قبل مرشح GFP والنهج التظليل. وهذا ما سمح الحفاظ على ضوء تشغيل خلال الحصول على الصور دون زيادة الضوضاء الكاميرا الخلفية.
تم تصميم صاحب العينة للطباعة 3D. ومع ذلك، فإن اختيار المواد أمر بالغ الأهمية كما كانت عدة البلاستيك التي تم اختبارها ليس 100٪ مستقرة، مما أدى إلى انحراف العينة. ولذلك، فمن المستحسن استخدام راتنجات بدلا من ذلك أو بناء على صاحب العينة من قبل الطحن البولي إثيلين (PEP) قضيب. عند استخدام الإعداد المجهر ورقة خفيفة مع نظام الإضاءة على الوجهين صاحب العينة قد تتداخل مع واحدة من الأوراق ضوء اعتمادا على زاوية دوران. للحد من إجهاد أثناء شفط المصنع من لوحة، واستخدام زاوية مسطحة من الملعقة. مصنع يمكن أن يجف بسرعة وتدفق الهواء التجربة للمرة الأولى. في محاولة لتجنب أي مشروع الهواء (الحركات السريعة، وتدفق المكيف)، التعليم الجامعير دون انقطاع، وحرك صاحب العينة إلى 1000 ميكرولتر طرف الماصة كلما أمكن ذلك. داخل المجهر، فمن الأهمية بمكان أن لا تراجع مصنع كامل في السائل والحفاظ على الأوراق الجافة.
تقنية مثالية لتصوير المراحل الأولى من تكوين الجذر الوحشي. عند إجراء التصوير على المدى الطويل من النصائح جذر ناضجة واحد يجب أن نضع في اعتبارنا أن جذور نبات الأرابيدوبسيس تنمو مع 100-300 ميكرون / ساعة بسرعة للخروج من مجال الرؤية. ويمكن أن يكون تنفيذ مفيد جدا في المستقبل خوارزمية تتبع الآلي، والتي من شأنها أن تسمح النمو طرف الجذر التالية على مدى فترات طويلة من الزمن. القدرة على التحكم في الظروف البيئية مثل الضوء وتكوين المغذيات من المتوسط خلال عملية الاستحواذ تسمح بالتحقيق في كيفية تكيف النباتات مع التغيرات. الجذر هو على اتصال مباشر مع الوسط السائل، والتي يمكن استخدامها لتطبيق الأدوية لتنشيط كيميائيا التعبير الجيني، على سبيل المثال باستخدام ديكساميثازون محرض 28 أو β-ESTRadiol نظام محرض 29. ومع ذلك، فإنه يستغرق وقتا طويلا لتبادل كامل حجم حجرة العينة لتغسل المخدرات. ويمكن تحسين الإعداد عن طريق التقليل من حجم حجرة العينة لتسريع تبادل المتوسط. ومع ذلك، هذه التقنية لديها امكانات كبيرة. مزيج الداخلي المتصاعد، ظروف النمو القياسية والحصول على الصور لطيف باستخدام ضوء ورقة المجهر يسمح دراسات طويلة الأجل للتنمية النباتات مع ارتفاع القرار على المستوى العضوي. وهذا سوف يساعد الباحثين على استكشاف الآليات الأساسية للتنمية النبات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ماتياس Fendrych للحرج القراءة / عرض وستيفان Stadlbauer لأجهزة سمعية. بفضل متجر آلة ميبا في IST النمسا لمساهمتهم في OpenSPIM. تلقت البحوث المؤدية إلى هذه النتائج بتمويل من برنامج الناس (تطبيقات ماري كوري) من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7 / 2007-2013) تحت REA اتفاقية منحة ن المجلس الأوروبي للبحوث (مشروع ERC-2011 ° [291734] و -StG-20101109-تطوير القطاع الخاص).
Materials
| Agarose, low melting | VWR | AFFY3282125GM | |
| Black aluminum foil | Thorlabs | BKF12 | |
| Black plastic foil | Carl Roth | HT83.2 | |
| LED blue (453 nm) | OSRAM | LD CN5M-1R1S-35-1 | |
| LED red (625 nm) | OSRAM | LR T66F-ABBB-1-1 | |
| LED board – PCB design software | Cadsoft Eagle | ||
| MES monohydrate | Duchefa | M1503.0100 | |
| Micropore Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Murashige & Skoog Medium (MS-Medium) | Duchefa | M0221 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Sample holder 3D print | i.materialise | https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1 | |
| Square petri dishes (245x245x25 mm) | VWR | 734-2179 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG |
References
- Grossmann, G., Guo, W. -. J., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Busch, W., Moore, B. T., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
- Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Methods. 11 (1), 22 (2015).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. Plant J. 36 (2), 280-290 (2003).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., et al. high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
- Höckendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative Analysis of Embryogenesis: A Perspective for Light Sheet Microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Methods. 12 (1), 23-26 (2015).
- Maizel, A., Von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).
- Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. PLoS ONE. 6 (6), e21303 (2011).
- Costa, A., Candeo, A., Fieramonti, L., Valentini, G., Bassi, A. Calcium Dynamics in Root Cells of Arabidopsis thaliana Visualized with Selective Plane Illumination Microscopy. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
- Šamajová, O., Takáč, T., von Wangenheim, D., Stelzer, E. H. K. Update on methods and techniques to study endocytosis in plants. Endocytosis in Plants. , 1-36 (2012).
- Rosquete, M. R., Von Wangenheim, D., et al. An auxin transport mechanism restricts positive orthogravitropism in lateral roots. Curr Biol. 23 (9), 817-822 (2013).
- Lucas, M., Kenobi, K., et al. Lateral root morphogenesis is dependent on the mechanical properties of the overlaying tissues. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (13), 5229-5234 (2013).
- Vermeer, J., von Wangenheim, D., et al. A Spatial Accommodation by Neighboring Cells Is Required for Organ Initiation in Arabidopsis. Science. 343 (6167), 178-183 (2014).
- Von Wangenheim, D., Daum, G., Lohmann, J. U., Stelzer, E. H. K., Maizel, A. Live Imaging of Arabidopsis Development. Arabidopsis Protocols. 1062, 539-550 (2014).
- Berson, T., von Wangenheim, D., et al. Trans-Golgi network localized small GTPase RabA1d is involved in cell plate formation and oscillatory root hair growth. BMC Plant Biol. 14 (1), 252 (2014).
- Langhans, M., Meckel, T. Single-molecule detection and tracking in plants. Protoplasma. 251 (2), 277-291 (2014).
- Novak, D., Kucharova, A., Ovecka, M., Komis, G., Samaj, J. Developmental nuclear localization and quantification of GFP-tagged EB1c in Arabidopsis root using light-sheet microscopy. Front Plant Sci. 6, (2015).
- Von Wangenheim, D., Fangerau, J., et al. Rules and Self-Organizing Properties of Post-embryonic Plant Organ Cell Division Patterns. Curr Biol. 26 (4), 439-449 (2016).
- Berthet, B., Maizel, A. Light sheet microscopy and live imaging of plants. J Microsc. , (2016).
- Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
- de Luis Balaguer, M. A., et al. Multi-sample Arabidopsis Growth and Imaging Chamber (MAGIC) for long term imaging in the ZEISS Lightsheet Z.1. Dev Biol. 419 (1), (2016).
- Ovečka, M., Vaškebová, L., Komis, G., Luptovčiak, I., Smertenko, A., Šamaj, J. Preparation of plants for developmental and cellular imaging by light-sheet microscopy. Nat Protoc. 10 (8), 1234-1247 (2015).
- Yokawa, K., Kagenishi, T., Kawano, T., Mancuso, S., Baluška, F. Illumination of Arabidopsis roots induces immediate burst of ROS production. Plant Signal Behav. 6 (10), 1460-1464 (2011).
- Silva-Navas, J., et al. D-Root: a system for cultivating plants with the roots in darkness or under different light conditions. Plant J. 84 (1), 244-255 (2015).
- Aoyama, T., Chua, N. -. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. Plant J. 11 (3), 605-612 (1997).
- Brand, L., et al. A versatile and reliable two-component system for tissue-specific gene induction in Arabidopsis. Plant Physiol. 141 (4), 1194-1204 (2006).
