JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫与感染

Bir Monosit Tek tabakalı Testi Kullanımı Fcy reseptör aracılı fagositoz değerlendirin

Published: January 02, 2017
doi:
10.3791/55039
,
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology,University of Toronto, 2Centre for Innovation,Canadian Blood Services

Summary

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis.

Abstract

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express FcγRs (e.g., FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, and FcγRIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of FcγR-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate FcγRs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out FcγR-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo FcγR-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of FcγR-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Introduction

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay originally developed to better predict blood transfusion outcomes in patients with auto- or alloantibodies to red blood cells (RBCs)1-5. By assessing the effect of anti-RBC antibodies in mediating Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis using this in vitro assay, it is possible to predict the clinical outcome in vivo. Indeed, the MMA has been used successfully to avoid immune destruction of antibody-bound RBCs, despite the transfusion of serologically incompatible blood5. The typical pre-transfusion procedure for compatibility testing, also termed crossmatching, involves serological methods that include typing the patient’s blood for ABO and Rh antigens and screening for the presence of anti-RBC antibodies in the patient6. Blood matched for ABO/Rh is selected, and if antibodies are present, an attempt to identify them is made so that blood for transfusion can be further selected to avoid these antigens. An ideal crossmatch result occurs when all donor blood is serologically compatible with the patient’s blood, which reduces the risk of post-transfusion hemolysis7. However, this system falls short for the small group of patients who have become alloimmunized upon repeated transfusion or pregnancy. These patients produce alloantibodies against specific RBC antigens. Some produce antibodies to antigens of very high frequency in the general population, and thus become progressively more difficult to crossmatch8,9. Adding to the complexity, not all alloantibodies are clinically significant; in other words, the binding of an alloantibody to RBCs detected by a serology test does not necessarily result in hemolysis when antigen-positive, incompatible blood is transfused. The MMA was originally developed to assess the potential clinical significance of serologically incompatible blood in a transfusion setting1-5.

Since extravascular hemolysis of antibody-bound RBCs is known to be mediated by the mononuclear phagocyte system, primary monocytes/macrophages are utilized in the development of diagnostic assays. The first assay to study the interaction of monocytes, RBCs, and antibodies was published in 1975, but the sub-optimal conditions used led only to rosette formation (the binding of RBCs to the periphery of the monocyte), and no phagocytosis was observed10. Significant modifications to the assay were made by several groups, leading to an assay for which the level of phagocytosis of alloantibody-bound RBCs could be correlated to the clinical outcome of hemolysis1-5. Recently, the optimal storage conditions of clinical samples and further optimization of assay conditions were examined to enhance the utility of a clinical MMA crossmatch using autologous patient samples11.

Three other diagnostic techniques have been employed in addition to the MMA in predicting transfusion outcomes: the 51Cr release test, the rosette test, and the chemiluminescence test (CLT). In the 51Cr release test, the patient is injected with 51Cr-labeled donor RBCs, and the half-life of the labeled RBCs is monitored and is predictive of post-transfusion survival or clearance12,13. As this method uses radioactive materials, it is rarely performed anymore. The rosette test involves mixing and incubating monocytes with RBCs and quantifying the level of rosette formation (with no phagocytosis)14. The clinical significance of antibodies in vivo involves active phagocytosis by macrophages found in the spleen and/or the liver; thus, this method does not provide a relevant readout of phagocytosis. The CLT uses luminol to monitor the oxidative burst during monocyte phagocytosis of RBC, since luminol fluoresces blue when oxidized in the phagosome15. This method is good, but contamination by neutrophils can confound the readout. Parallel comparisons have been made to evaluate the sensitivity, practicality, and reproducibility of the four available methods, and both the CLT and MMA were ranked superior16. However, the CLT has been mainly utilized in assessing hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN), and the assay’s optimal pH of 8.0 might compromise the level of phagocytosis11.

In addition to its diagnostic and clinical utility, the MMA has been modified for other research purposes. Indeed, the MMA can not only serve as a functional assay to address discrepancies between serology and biology, it has also been used to retrospectively investigate the cause of hemolysis after intravenous immunoglobulin (IVIG) therapy17. It has also been used to examine the structure-function of chemical inhibitors of FcγR-mediated phagocytosis18-20 and to study the downstream signaling of FcγR-mediated phagocytosis21. In our laboratory, in addition to using a human MMA, we are developing a murine MMA using primary mouse peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and autologous RBCs. The rationale is to screen antibodies that can induce FcγR-mediated phagocytosis as an intermediate to developing an in vivo autoimmune hemolytic anemia (AIHA) mouse model (unpublished data). The various modifications focus on different aspects of the IgG antibody and FcγR interaction that induce phagocytosis.

Protocol

araştırma etik kurulu / kurumsal inceleme kurulu tarafından insan örneklerin kullanımı için onay almak ve tüm insan donörlerden imzalı onayını alın. MMA, aynı zamanda hayvan kullanımı etik onaylandıktan sonra, insan deneyinde benzer şekilde fare PBMC'ler kullanılarak gerçekleştirilebilir. MMA aseptik doku kültürü teknikleri uygulanmaktadır. NOT: Şekil 1'e bakınız. NOT: Biz yöntem yalnızca bir "kısa vadeli" kültür yöntemi olarak, aseptik teknik korumak için tahlil sırasında bir seviye 2 biyosınırlılık kabine kullanımını tavsiye rağmen, bakteri tahlili kirletmesine için gerçekten yeterli zaman yoktur. Bir seviye 2 biyosınırlılık kabine var, yerine sadece bu deney için bir tane satın almaz, bu nedenle, tahlil açık bankta, bir biyosınırlılık kabine dışında gerçekleştirilebilir. % 5 CO2 içeren bir 37 ° C kuluçka makinesi kullanımı, bununla birlikte, bir seçenek değildir ve kullanılmalıdıren iyi sonuçlar. 1. Periferik Kan Mononükleer Hücre İzolasyon sağlıklı bir donörün ya da asit sitrat dekstroz (ACD) antikoagülan (sarı-kapaklı) ihtiva eden Vacutainers kullanılarak venipunktür yoluyla bir hastanın insan tam kan alınmasıdır. Not: Tam kan bir sonraki aşamada 11 geçmeden önce 36 saat boyunca oda sıcaklığında (18-22 ° C), ACD saklanabilir. Normal olarak, tam kan Ekim 1-2 mL'lik boşaylı tüpler deneyi için yeterlidir. Tam Kan 1 seyreltilir: 1 h / (% 10 fetal bovin serumu, 20 mM HEPES, ve 0.01 mg / ml gentamisin ile takviye edilmiş RPMI-1640), sıcak tam RPMI ortamında h. Üretici tarafından tavsiye edilen şekilde yoğunluk gradyan santrifüj ile seyreltildi tam kandan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC), izole (Malzeme listesine bakınız). yoğunluk gradyanı üzerinde çok yavaş seyreltilmiş kan tabakanın (oda sıcaklığı, 18-22 ° C sıcaklığa getirilmiştir). NOT: Mixi miktarını en aza indirindikkatli bir şekilde damla damla kan karışımı katman veya bir pipet kullanarak kan uygun ayrılması için arayüzde ng. Kan karışımı yavaş yavaş yoğunluk gradyanı yakın pipet ucu yerleştirerek ve çok yavaş tüp tarafı aşağı çalıştırmak için kan karışımı sağlayarak yoğunluk gradyanı üst üzerinde katman izin verin. 50 mL deney ölçekli tabaka kan (15 ml tüp içinde) yoğunluk gradyanı 3 mL üstünde karışımı ya da katmanın yoğunluğu gradyanı (15 mL üstünde kan karışımı 35 mL ve 10 mL bağlı olarak tüp). Tipik olarak, tam kan, 10 ml bir verici-to-verici varyasyon ile 10.000.000 PBMC'ler verir. NOT: Bu yoğunluk gradyanı ile kan karışımının karıştırma olduğu çok önemlidir. Kan karışımı yoğunluk gradiyenti üzerinde katman ve tüm kan yoğunluğu degrade üstünde olana kadar yavaş yavaş artacaktır. Frensiz 30 dakika boyunca 700 xg'de katmanlı karışımı santrifüj. centrPlazma, ince beyaz tabaka (PBMC ihtiva eden), yoğunluk gradyanlı malzemesi, granülositler ve eritrosit: ifuged karışımı (üstten alta doğru) 5 katmanlara ayrılması gerekir. Çıkarın ve plazma çoğunluğu atmak ve dikkatli bir Pasteur pipeti ve bir emme ampul kullanarak yeni bir 15-ml tüp içine buffy coat (hücre) içerik alın. Not: ince beyaz tabaka tabakasının kaldırılması etkili tabakasının dış çevresinde dairesel bir hareketle gerçekleştirirken tüpün karşısında pipet ucu ile, Pasteur pipeti ile emme uygulanması ile yapılır. yıkama arasında (tam fren ile), 10 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj izole edilen PBMC, pH 7.3 fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde üç kez yıkanır. tam RPMI ortamı içinde PBMC topağı sulandırın. pelet boyutuna bağlı olarak, orta 3-7 ml yeterlidir. tripan mavisi ve hemasitometre kullanarak PBMC güvenin. Sadece tripan mavisi ile boyanan edilmeyen hücreleri saymak. Reconstituttam RPMI ortamı içinde 1.750.000 hücre / ml e PBMC'ler. 8 bölmeli sürgünün her oyuğuna Tohum 400 uL (700,000 hücre). 37 ° C, tamamen nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörü içinde inkübe slayt monosit / makrofajlar yapışmasının sağlanması için 1 saat süre ile (% 5 CO2 ile takviye edilmiş). Yapıştırılır Monositler 2. Ön arıtma NOT: fagositozu inhibe veya geliştirmek için yollar arıyor Bu adım gereklidir. Ön muamele çıkar ilaç (lar) ya da bileşim (ler) ile birlikte monosit yapıştırılır. tam RPMI ortamı kullanılarak istenen konsantrasyona ilaç (lar) veya diğer test malzemesi sulandırın. Not: Örneğin, IVIG, 200 ug / mL, genellikle insan monositlerini kullanıldığında fagositoz bir% 95-100 inhibisyonunu elde etmek için kullanılır. Aspire (adım 1.6) sonra 1 saatlik inkübasyondan sonra, 8 bölmeli slayt herhangi yıkanarak yapışmayan hücreler ihtiva eden üst sıvıyı atmak ve. 400 ile değiştirinBir ilaç veya başka bir tedavi uL 37 ° C 'de 1 saat süre ile inkübe edilir. aspirasyon ve 8 bölmeli slayt çözümler değiştirirken, zayıf yapışmış hücreler kaldırın yok ki sıvıların akışını kontrol etmek emin olun. Ayrıca, bir seferde sadece 2-3 boş kuyular ile çalışmak ve kuyu kurumasını önlemek. Not: Genellikle, her bir tedavi, teknik üç kez gerçekleştirilir. R 3. Opsonizasyon 2 R 2 Kırmızı Kan Hücreleri Not: Burada kullanılan R2 R2 kan toplama merkezinde (Kanada Kan Hizmetleri) elde edilmiştir, ancak aynı zamanda ticari olarak temin edilebilir. Opsonize R2 R2 eritrosit FcyR aracılı fagositozu için bir pozitif kontrol olarak kullanılır. Naif R2 R2 1 aya kadar 4 ° C 'de Alsever çözeltisi (uzatmak için, raf ömrü) saklanmalıdır. Alsever çözeltisi içinde yapılan ve 0.8 oluşmaktadırAğ / hac% trisodyum sitrat (dihidrat), ağ% 1.9 / hac dekstroz, ağ% 0.42 / hac sodyum klorür ve% 0.05 w / h sitrik asit (monohidrat) w. R2 eşittir R ise 2 hücreleri, R1 R2, 1 R1, R1 R, ya da R 2R, kullanılabilir diğer Rh fenotiplenir hücreleri, mevcut değildir. Yıkama R2 R2 (CDE / CDE) PBS içinde kırmızı kan hücreleri, her biri 5 dakika 350 x g'de santrifüj ile üç kez olmak üzere toplam. NOT: Gerekli eritrosit miktarı deneysel büyüklüğüne bağlıdır ve arka hesaplanmış olabilir. Eritrositler bağlı liziz veya yüzer çıkarılması sırasında, her yıkama sırasında kaybolur yana zaman, eritrosit aşırı miktarda yıkayın. Örneğin, teknik üç kez yapılan 5 tedavileri ve 2 kontrolleri, tüm bir deneyde, 21 kuyu toplam vardır. 400 uL / ​​oyuk, 1.25% eritrosit karışımı ile 21 kuyu paketlenmiş 105 uL, RBC gerekli opsonize gösterir. 200 RBC ul başlangıçta yıkanmalıdır ve 150 & #181 L fagositoz adım için eritrosit yeterli bir miktarda olduğundan emin olmak için opsonize edilmelidir. 1 ile yıkandı, R2 R2 pelet opsonize: insan serumundan 1 h / h poliklonal anti-D antikorları ve aralıklı karıştırma ile, 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir. Not: poliklonal anti-D antikorları mevcut değilse, ticari olarak temin edilebilir monoklonal anti-D antikoru, ya da kan bankaları ve nakli yoluyla elde edilebilir, normal olarak Rh bağışıklık profilaksisi için kullanılan anti-D, kullanmak mümkündür Hizmetler. tahlil kurarken, ve un-titre poliklonal antikorların çok geçiş ne zaman ya da bir monoklonal antikor geçiş Optimizasyon test, başında yapılmalıdır. Bu bir antiglobulin testi 3+ ile 4 + ve sayılan 100 monositler başına 70-90 arasında fagosite RBCs bir fagositoz sonucu (IAT) sonuç için gerekli optimal konsantrasyonunu veya anti-D hacmini tespit etmektir. opsonize yıkayınD R2 R2 her biri 5 dakika 350 x g'de santrifüj kullanılarak PBS içinde üç kez olmak üzere toplam. Not: R 2 R2 başarılı opsonizasyon dolaylı IAT'yi gerçekleştirerek kontrol edilebilir. Kısaca, sekonder poliklonal anti-insan antikorları, RBC yüzeylerde primer opsonizasyon antikorların bağlandığı ilave edilir ve yükseltilmiş sinyal hemaglütinasyon şeklinde gözlenebilir. Ayrıntılı bir üretici protokolü ek malzemeler dosyasında bulunabilir. % 1.25 hacim / hacim tam RPMI ortamı kullanılarak yıkanarak R2 R2 pelet sulandırın. Not: Aşırı opsonize edilmiş R2 R2, bir haftaya kadar 4 ° C 'de Alsever çözeltisi içindeki saklanabilir. 4. Fc reseptör aracılı fagositoz 8 bölmeli slayt ilaç veya orta süpernatan aspire ve% 1.25 hacim / hacim R2 R2 kanşımı 400 uL ekleyin. 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. kıçtaer inkübasyon 2 saat, üreticinin adaptörler kullanarak odaları kaldırın. Bir kağıt havlu üzerine aşırı R2 R 2 kapalı hafifçe sürün. slayt kurumasına olmadığından emin olun. PBS ile 100 ml beher doldurun. Batmak ve yavaş yavaş un-fagosite R2 R2 çoğunluğu kaldırmak için ileri ve geri (30-40 vuruş civarında) slayt hareket ettirerek slayt yıkayın. PBS slaytı çıkarın. Bir kağıt havlu ya da doku ve kullanarak aşırı PBS kapalı ıslatın slayt hava-kurutun. 45 sn için% 100 metanol hava ile kurutulmuş slayt düzeltildi. Ardından, sabit slayt hava kurutun. NOT: Slaytlar gibi Grünwald-Giemsa 21 veya Wright-Giemsa 22 olarak, aşağı boyanması için daha uyumlu başka bir yöntemi kullanarak tespit edilebilir. Bir Elvanol montaj orta (veya başka bir piyasada mevcut montaj orta) ev yapımı-ve eklemek lamelleri kullanarak slayt monte edin. NOT: Elvanol montaj orta / h po ağırlık% 15 oluşurPBS lyvinyl alkol reçinesi ve% 30 hac / hac gliserin. Bütün reçine eridikten kadar karışım ısıtıldı ve gliserin berrak bir karışım. Bu, diğer ticari olarak temin edilebilen montaj ortamı ile ikame edilmiş olabilir. montaj ölçümü gecede önce kurumasını bekleyin. Fagositoz 5. Niceleme Bir faz-kontrast mikroskop ve 40X objektif lens kullanarak el ile en az 200 monositler ve bu monositler içinde fagosite R2 R2 sayısının sayılmasıyla fagositik etkinlik miktarını ölçmek. Aynı anda monosit sayısını ve fagosite R2 R2 sayısını ölçmek için her el bir sayaç var. Monositler sayısına göre fagosite R2 R2 sayısına bölünmesiyle ve 100 Express ortalama (SEM) ortalama ± standart sapma olarak veri (ortalama fagositik indeks) ile çarparak ortalama fagositik indeksi edinin. </li>

Representative Results

Şekil 1, yukarıda belirtilen prosedür çok önemli adımı takip ederek, MMA tekrarlanabilir gerçekleştirilebilir. IVIG, Şekil 2'de fagositoz engellenmesi için bir örnek olarak kullanılmıştır. IVIG, böylece fagositoz alt sonucu inhibe bağlanan ve Fc reseptörleri bloke bilinmektedir. Kullanılan IVIG miktarının titre edilmesiyle, doza bağlı bir inhibisyon hangi / ml Tüm (Şekil 2A) olarak inhibe etmedi / mL 0.5 ug altında% 100 inhibisyon yakındır ve konsantrasyonlarına yol 200 ug üzerindeki konsantrasyonlarda, görülmektedir. Fagositik endeksler dönüştürülmüş ve% 0 inhibisyon / ml belirlenebilir 3 ug bir IC50 (Şekil 2B) olan bir inhibisyon eğrisi olarak R2 R2 pozitif kontrol normalize edildiğinde. Sürekli tahlili gerçekleştirmek ek olarak quantificaDeneyin tion bazen zor olabilir. Şekil 3, çeşitli MMA slaytların faz-kontrast mikroskobu görüntüleri topluluğudur. Mikroskopi tecrübesi ile, biri kirletici RBC (Şekil 3B), ya da bir fagosite RBC (Şekil 3B) bir vakuol bir monosit ayırt edebilirsiniz. Hücreler ve / veya kalıntı yoğun kümeleri miktar (Şekil 3E ve F) sırasında kaçınılmalıdır. Ayrıca, bir kaçının aşırı opsonizasyon monosit iç overcrowds ve doğru miktarının (Şekil 3C) müdahale artan fagositoz yol açacak R2 R 2 RBC. MMA 1. şematik diyagramı Şekil. MMA önemli adımlardan bir adım adım tasviri: tam kandan PBMC izole yapıştırılmış monocyt beslemeopsonize R2 R2, ve oda slaytlar yıkama ile es. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2. İntravenöz IgG (IVIG) MMA kullanılarak in vitro fagositozu inhibe eder. IVIG fagositosisi bastırmak bilinmektedir ve insan MMA bir inhibisyon kontrolü olarak kullanılmıştır. Muamele edilmemiş R2 R2 kontrolle kıyaslandığında IVIG (A) titrasyon fagositoz doza bağlı olarak önlenmesi ile sonuçlandı. Sonuçlar ortalama n = 3 deney (SEM) ortalama ± standart sapma göstermektedir. Istatistiksel analiz Student t-testi kullanılarak yapılmıştır: ** p≤0.01 ve *** p≤0.001. (B) bir IC50 O ile IVIG önleme eğrisiF 3 ug / ml (kesikli çizgi). Sonuçlar işlenmemiş R2 R2 (% 0 inhibisyon) normalize verileri gösterir; n = 3 deney ortalama ± SEM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 40X büyütme altında örnek slaytlar Şekil 3. Faz-kontrast mikroskobu görüntüleri. (A) monositler arka plan (beyaz oklar) çok az kirletici, un-fagosite R2 R2 ile, ortalama (ayırt edici bir hale ışıltı ile siyah oklar) 1-2 R 2 R 2 fagosite ettiği mükemmel slayt. Fagosite R2 R2 için yanlış olabilir bu slaytta gösterildiği gibi (B), monositler bazen genişlemiş olması vakuoller (beyaz oklar). (C </ strong>) fazla 4-5 R 2 monosit başına R2 (siyah oklar fagosite, opsonize aşırı R2 R2 olmuştur zaman) R2 2 monosit ve farklı hücre içinde kalabalık beri doğru, zor sayma hale sınırları ayırt edilemez. (D) slayt yetersiz yıkama yapıştırılır eritrosit için yanlış olabilir bol R2 R2 kontaminasyon (beyaz oklar) yol açar. (E) Bazen, monositler ve kirletici eritrositler kümeleri oluşturabilir. Kümeler de kaçınılmalıdır bakteri kontaminasyonu, gösterir. (F) monositler miktarının esnasında önüne geçilmesi gerekmektedir daha büyük agregalar oluşturabilirler. görüntülemek için alanları rasgele seçim kullanarak, panel A MMA düzgün yapılmış ise genellikle gözlenmektedir budur. Ölçek çubuğu 20 mm. Lütfen buraya tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

Discussion

MMA doku kültürü ve mikroskopi hem de uzmanlık gerektiren zahmetli bir tekniktir. başarı sağlamak için birkaç kritik adımlar vardır: monosit tek tabaka 1) nesil; RBCs 2) opsonizasyon, ve 3) manuel miktar. Monosit tek tabakalı odası slayt çok güçlü bir şekilde bağlı değildir, bu yüzden, fizyolojik pH tahlilinde 11 boyunca muhafaza edilmesi ve PBMC yeterli sayıda tohumlanır edilmelidir. yapıştırılır hücreleri bozacağı Dinç pipetleme, kaçınılmalıdır. Bir yaklaşım her zaman kaldırmak ve odanın aynı köşesinden çözümler ekleyebilir ve hareket yavaş ve istikrarlı olmasını sağlamak için olmaktır. Benzer şekilde, fazla RBC çıkarmak için son yıkama aşaması sırasında, hareket yavaş ve sabit olmalıdır. hala un-fagosite eritrosit çoğunluğunu kaldırılırken Bu tek tabaka minimal rahatsızlık sağlar. Yetersiz yıkama manuel nereye yapar kirlenmesine eritrosit yüksek arka plan yol açacaktırntification zor. İkinci olarak, R2 R2 eritrosit yeterli fagositoz kontrolü için 80-120 arasında bir ortalama fagositik endeksi elde etmek için opsonize gerekmektedir. Bu istenen fagositik aralığı sayma kolaylığı arasında bir denge ve istatistiksel analiz için fagositoz yeterli miktarda muhafaza (örneğin, 5'ten fazla olan monositler eritrositler doğru ölçmek zordur fagosite). opsonızasyonu derecesi bir IAT tarafından teyit edilebilir ve 4+ için 3+ arasında bir okuma gereklidir. 2 eritrosit var yüzer koyu kırmızı olduğunda, yıkama sırasında aşırı liziz, ya da atılmalıdır R 2R fagositoz önemli bir azalma nedeniyle depolama hücrelerinin yaşlanmaya deneylerde zaman. laboratuar personeli arasındaki ve deneyler arasındaki sayıları karşılaştırarak özellikle Son olarak, mikroskop kullanarak manuel miktar yanıltıcı olabilir. her bir aynı alan inceleyerek, ya da sadece daha fazla hücre sayılarak, Daha tutarlı bir sayısı elde edilebilir. deneyimli bir teknisyen ve eğitim slaytları belirli bir dizi kullanımı ile yan-yana eğitim tavsiye edilir.

MMA önemli bir eleştiri manuel miktar adım öznellik olduğunu. Ancak, yeterli eğitim, tutarlılık farklı sayaçlar üzerinden elde edilebilir. Başka bir sınırlama insan örnekleri ile ilgili veri varyasyon kaynağıdır 2 R 2 yüzey antijeni ifade seviyeleri, monosit fagositik yeteneklerine ve Ar içsel donör için-donör farklılıklarıdır.

Diğer alternatif teknikler FcyR aracılı fagositozu incelenmesi için kullanılabilir. Ticari kitler çoğunluğu fagositoz izlemek için flüoresan çıkış kullanır (örneğin, bioparticles, pH'a duyarlı floresan proteini veya IgG-etiketli floresan lateks boncuk). Floresan çıkış kullanımı daha objektif ölçümü teklif yok, ama bir de con gerekiyorbir flüoresan mikroskop ya da bir akış sitometresinde yanı sıra ticari olarak temin edilebilen kitler üzerine takip eden bağımlı kullanımı ile ortaya çıkan durumu, maliyet ve eğitim sider.

Son olarak, bu deney, bir araştırma söz bağlı olarak değiştirilebilir. Fagositoz ilaç engellenmesini test ederken, örneğin, monositler ön tedavi edilebilir ya da ilaç ve opsonize edilmiş RBCs (yani, bir rekabet deneyi) her ikisi ile ko-inkübe edilmiştir. farklı alt kimerik antikorlar veya yeniden birleştirici yapıları antikorların aşağı doğru sinyal de test edilebilir. Evrensel bir antijen boş kanın 24 gelişiminde son buluşlarla, MMA fagositoz tetikleyen bir alçaltılmış etkinliği gerçekten var olup olmadığını değerlendirmek için çeşitli antikorlar ile bu antijen boş RBCs ilk ekranlarında yararlanılabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank the Canadian Blood Services for a Graduate Fellowship Program Award to T.N.T. This research received financial support from the Canadian Blood Services’ Centre for Innovation, funded by the federal government (Health Canada) and the provincial and territorial ministries of health. The views herein do not reflect the views of the federal, provincial, or territorial governments in Canada.

Materials

Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers BD REF364606
RPMI 1640 Sigma R8758
HEPES Bioshop HEP003.100
Fetal bovine serum Multicell  080150
Gentamicin Gibco 15710-64
Ficoll-Paque PLUS GE 17-1440-03 https://www.gelifesciences.com/
Phosphate buffered saline Sigma D8537
8-chamber slides Lab-Tek-ll 154534
R2R2 (cDE/cDE) red blood cells  Canadian Blood Services Commercially available (e.g. http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells) 
Polyclonal anti-D from human serum Gamma Biologics DIN 02247724 Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin
100% methanol Caledon 6700-1-42
Polyvinyl alcohol resin Sigma P8136 Can be substituted with commercially available mount
UltraPure glycerine Invitrogen 15514-011
Cover slips VWR 48366 067
Novaclone anti-IgG Immucorgamma 5461023 Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/…/ucm081743.pdf)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunt, J. S., Beck, M. L., Hardman, J. T., Tegtmeier, G. E., Bayer, W. L. Characterization of human erythrocyte alloantibodies by IgG subclass and monocyte interaction. Am J Clin Pathol. 74 (3), 259-264 (1980).
  2. Schanfield, M. S., Stevens, J. O., Bauman, D. The detection of clinically significant erythrocyte alloantibodies using a human mononuclear phagocyte assay. Transfusion. 21 (5), 571-576 (1981).
  3. Branch, D. R., Gallagher, M. T., Mison, A. P., Sysiokian, A. L., Petz, L. D. In vitro determination of red cell alloantibody significance using an assay of monocyte-macrophage interaction with sensitized erythrocytes. Br J Haematol. 56 (1), 19-29 (1984).
  4. Hunt, J. S., Beck, M. L., Wood, G. W. Monocyte-mediated erythrocyte destruction. A comparative study of current methods. Transfusion. 21 (6), 735-738 (1981).
  5. Noumsi, G. T., Billingsley, K. L., Moulds, J. M. Successful transfusion of antigen positive blood to alloimmunised patients using a monocyte monolayer assay. Transfus Med. 25 (2), 92-100 (2015).
  6. Moulds, J. M. Introduction to antibodies and complement. Transf Apher Sci. 40 (3), 185-188 (2009).
  7. Grandstaff Moulds, M. K. Antibody identification. Transf Apher Sci. 40 (3), 195-197 (2009).
  8. Hendrickson, J. E., Tormey, C. A., Shaz, B. H. Red blood cell alloimmunization mitigation strategies. Transfus Med Rev. 28 (3), 137-144 (2014).
  9. Hamilton, J. R. Common and frequently encountered antibodies. Transfus Apher Sci. 40 (3), 189-194 (2009).
  10. Kenna, M. A., Cooper, R. A., Schrieber, A. D. Effect of papain on the interaction between human monocytes, erythrocytes and IgG. Blood. 46 (2), 245-252 (1975).
  11. Tong, T. N., et al. Optimal conditions for the performance of a monocyte monolayer assay. Transfusion. , (2016).
  12. Gray, S. J., Sterling, K. The tagging of red cells and plasma proteins with radioactive chromium. J Clin Invest. 29 (12), 1604-1613 (1950).
  13. Mollison, P. L., Veall, N. The use of the isotope 51Cr as a label for red cells. Br J Haematol. 1 (1), 62-74 (1955).
  14. Sebring, E. S., Polesky, H. F. Detection of fetal hemorrhage in Rh immune globulin candidates. A rosetting technique using enzyme-treated Rh2Rh2 indicator erythrocytes. Transfusion. 22 (6), 468-471 (1982).
  15. Downing, I., Templeton, J. G., Mitchell, R., Fraser, R. H. A chemiluminescence assay for erythrophagocytosis. J Biolumin Chemilumin. 5 (4), 243-250 (1990).
  16. Fabron, A., et al. Application of noninvasive phagocytic cellular assays using autologous monocytes to assess red cell alloantibodies in sickle cell patients. Transfus Apher Sci. 31 (1), 29-35 (2004).
  17. Michelis, F. V., et al. Acute hemolysis after intravenous immunoglobulin amid host factors of ABO-mismatched bone marrow transplantation, inflammation, and activated mononuclear phagocytes. Transfusion. 54 (3), 681-690 (2014).
  18. Rampersad, G. C., et al. Chemical compounds that target thiol-disulfide groups on mononuclear phagocytes inhibit immune mediated phagocytosis of red blood cells. Transfusion. 45 (3), 384-393 (2005).
  19. Purohit, M. K., et al. Structure-activity relationships of pyrazole derivatives as potential therapeutics for immune thrombocytopenias. Bioorg Med Chem. 22 (9), 2739-2752 (2014).
  20. Neschadim, A., Kotra, L. P., Branch, D. R. Small molecule phagocytosis inhibitors for immune cytopenias. Autoimmun Rev. 15 (8), 843-847 (2016).
  21. Fitzer-Attas, C. J., et al. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis in macrophages lacking the Src family tyrosine kinases Hck, Fgr, and Lyn. J. Exp Med. 191 (4), 669-682 (2000).
  22. Allhorn, M., et al. The IgG-specific endoglycosidase EndoS inhibits both cellular and complement-mediated autoimmune hemolysis. Blood. 115 (24), 5080-5088 (2010).
  23. Li, L., et al. Inhibition of phagocytic recognition of anti-D opsonized Rh D+ RBC by polymer-mediate immunocamouflage. Am J Hematol. 90 (12), 1165-1170 (2015).
  24. Kwan, D. H., et al. Toward efficient enzymes for the generation of universal blood through structure-guided directed evolution. J Am Chem Soc. 137 (17), 5695-5705 (2015).

Tags

Monocyte Monolayer AssayFc Receptor-mediated PhagocytosisImmunohematologyBlood TransfusionAuto-antibodiesAllo-antibodiesRed Blood CellsOpsonizationPolyclonal Anti-D AntibodiesPBMCDensity Gradient CentrifugationIn Vitro Functional Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tong, T. N., Branch, D. R. Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fcγ Receptor-mediated Phagocytosis. J. Vis. Exp. (119), e55039, doi:10.3791/55039 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image