Inoculador<em> Anopheles gambiae</em> Los mosquitos con los granos para inducir y medir la respuesta inmune melanización
Summary
Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.
Abstract
La estimulación de la respuesta inmune es una herramienta común en estudios de invertebrados para examinar la eficacia y los mecanismos de la inmunidad. Esta estimulación se basa en la inyección de partículas no patógenos en los insectos, como las partículas serán detectados por el sistema inmune y inducirán la producción de efectores inmunes. Nos centramos aquí en la estimulación de la respuesta melanización en el mosquito Anopheles gambiae. Los resultados melanization respuesta en la encapsulación de partículas extrañas y parásitos con una capa oscura de melanina. Para estimular esta respuesta, los mosquitos se inoculan con los granos en la cavidad torácica utilizando tubos de vidrio microcapilar. Entonces, después de 24 horas, los mosquitos se disecan para recuperar las perlas. El grado de melanización de la perla se mide usando software de análisis de imágenes. Perlas no tienen los efectos patógenos de los parásitos, o su capacidad para evadir o suprimen la respuesta inmune. Estas inyecciones son una manera de Measure eficacia inmunológica y el impacto de los estímulos inmunes en otros rasgos de historia de vida, tales como la fecundidad o la longevidad. No es exactamente lo mismo que estudiar directamente las interacciones huésped-parásito, pero es una interesante herramienta para estudiar la inmunidad y su ecología evolutiva.
Introduction
Los insectos se basan en las respuestas inmunitarias para protegerse contra los parásitos y patógenos 1 – 3 que violan a través de su cutícula o el epitelio del intestino medio 4. En los mosquitos, estas respuestas son eficaces contra las bacterias, virus 5 6 7 filaria, nematodos, parásitos de la malaria y 1,8,9. En los mosquitos, una respuesta inmune clave es la encapsulación de partículas extrañas con melanina 10 – 12. Esta encapsulación puede ocurrir en el intestino medio o en la hemolinfa sistema de circulación de 10 a 12. Este melanization respuesta es el resultado de la pro-fenoloxidasa cascada 10 – 12, y puede conducir a la muerte de los parásitos o para su fagocitosis. En los mosquitos adultos, donde el número de células de hemocitos es limitado, melanización es una respuesta humoral, al igual que contra los parásitos Plasmodium o nematodos filarias 7.En algunos otros insectos, que está directamente las células de hemocitos que se reúnen alrededor del parásito a melanize ellas 7. Además, la melanina es también esencial para varios otros procesos fisiológicos como la producción de huevos y heridas de cicatrización de la cutícula 7.
La estimulación de la respuesta inmune se utiliza como una herramienta para estudiar la inmunidad de insectos en varios sistemas modelo de salud pública agrícola y 13 – 18. Se utiliza en los mosquitos Anopheles gambiae, el principal vector de la malaria en África, para estudiar las interacciones huésped-parásito 14 – 16,19. Estas técnicas se basan en la capacidad de los insectos para detectar parásitos con sus receptores de reconocimiento de patrones (PRR) 2. Los mosquitos también pueden detectar otras moléculas que interfieren con su biología, tales como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), o detectar sus propias células dañadas debido a la liberación de colágeno y ácidos nucleicos. La célula inmune mosquitos tales como los hemocitos se utilizan para la detección de 20 – 23. Las principales vías de señalización son inmunes IMD, peaje, JAK / STAT 24, y la interferencia de ácido ribonucleico (RNAi) 25,26. Tanto peaje y vías IMD influyen en la melanization respuesta e interactúan con el pro-fenoloxidasa en cascada 10 – 12.
La herramienta estándar que se utiliza para estimular la respuesta melanización es la inoculación de un mosquito con una pequeña gota en la hemolinfa de la cavidad torácica. El grado de encapsulación de melanina a continuación, se puede medir 19 después de recuperar el cordón a través de la disección del mosquito. En la mayoría de estudios, sólo un talón se inyectó por mosquito 15,16,27, pero la inyección de más cuentas es posible con el fin de estudiar los límites de la respuesta melanización 19. Estas perlas se inyectan usando una solución de inyección (suero fisiológico) para limitar la perturbación de la fisiología y mosquitola desecación del mosquito 15,16,27. Un colorante se añade a esta solución para facilitar la selección de perlas. Es lo mismo para la solución de disección se utiliza para recuperar el 15,16,27 talón.
La ventaja de la inoculación de los insectos con los estímulos no patógena es la capacidad de concentrarse en el efecto directo sobre la respuesta inmune. No hay efectos que complican debido a la patogenicidad del parásito 28, inmunosupresión 29 – 31, o el 31 de evasión inmune – de 34. Además, las consecuencias de las estimulaciones en otros rasgos de historia de vida, tales como la longevidad o la fecundidad, pueden también ser estudiados. Por lo tanto, los investigadores que estudian la ecología evolutiva pueden requerir este tipo de herramientas 2,35,36. Por ejemplo, los abejorros inmuno-desafió tienen una vida más corta en virtud de la inanición. efectos negativos similares de estímulos inmunes y las implementaciones se han observado en diferentes modelos de invertebrados, a menudo resulta en un cortoer vida útil o el éxito reproductivo menos 13,27,37. Tales estudios pueden llevarse a cabo en diversos entornos 2,4,38. Estimular la inmunidad es también de interés para los que se centran directamente en la inmunopatología 39,40.
Este protocolo se basa en la inoculación de los granos con los mosquitos para estimular la respuesta melanización y directamente medir la cantidad de melanina. Esto permite el estudio cuantitativo y cualitativo de la melanization respuesta en diferentes parámetros experimentales. Tal herramienta se puede extender a la estimulación de otras respuestas inmunes, tales como la respuesta a las bacterias antibacteriano 41 muertos por calor. También puede llevarse a cabo en muchos entornos ecológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta técnica de inyección es útil para estimular y estudiar la melanization respuesta en los mosquitos. Por ejemplo, aquí se estudió el efecto de la carga de estímulos inmune.
El paso crítico en este procedimiento es para inocular apropiadamente el mosquito. Cualquier daño excesivo a los músculos de vuelo o al propio mosquito puede prevenir el mosquito de la alimentación o puede acabar con él antes de la disección. Un segundo paso clave es mantener a los mosquitos en el hielo el …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was possible through funding from the University of Neuchâtel. We would like to thank all the students that helped in improving this technique, namely our colleague Kevin Thievent. We would also like to thank the members of the Thomas Lab for making their laboratory available. We would like to thank Janet Teeple for her help with mosquito rearing. We would also like to thanks Loyal Hall in the laboratory of Pr. Tom Baker for his help in the preparation of the micro capillary glass tubes.
Materials
| Microcapillary glass tubes GB120TF-10 | science-products.com | GB120TF-10 | http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html |
| Microcaps Capillary pipette bulb | Drumond | 1-000-9000 | |
| negatively charged Sephadex CM C-25 beads | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | C25120 SIGMA | need few to start |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | 323829 ALDRICH | need few to start |
| Software ImageJ | opensource | Version 1.47f7 or later |
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