Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome
Summary
We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.
Abstract
Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.
Introduction
Planten produceren zaden, die aanleiding geven tot de volgende generatie te geven. Zaden accumuleren van grote hoeveelheden opslagreserves, zoals oliën, koolhydraten en eiwitten, na kiemkracht groei. Mensen maken gebruik van zaad opslag reserves als bron van levensmiddelen en diervoeders, en dus plantenzaden zijn een van de belangrijkste leveranciers van eetbare organische stof wereldwijd. Het verhogen van zaad opbrengst is een belangrijke uitdaging in de plantkunde.
Sinds zaad opslag reserves zijn in de handel waardevolle bronnen van voedsel en industriële materialen, hebben de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulering van het metabolisme van deze reserves op grote schaal onderzocht 1-6. Verder ophelderen van deze mechanismen nuttig zijn voor het verhogen van zaadopbrengst in gewassen. Zaden ontwikkelen fabriek eierstokken na de bevruchting, en ze volwassen worden door middel van een reeks van ontwikkelingsstadia 1,6,7. Verder inzicht in de moleculaire mechanisme onderliggende zaad ontwikkeling vereist gedetailleerdeNauwkeurige genexpressieprofielen van een aantal ontwikkelende zaden te produceren. De grote hoeveelheden van oliën, eiwitten, koolhydraten en polyfenolen in plantenzaden bemoeilijken sterk gezuiverd RNA, dat nauwkeurige profilering van genexpressie uitsluit isoleren.
Hier introduceren we een efficiënte methode voor RNA-isolatie uit oliezaden die grote hoeveelheden oliën, eiwitten en polyfenolen. Bij deze methode zal onderzoekers kunnen sterk gezuiverde RNA te bereiden. Dergelijke RNA zal nuttig zijn voor het bewaken van transcriptionele veranderingen in de belangrijkste genen regelen van de metabole regulatie van het zaad opslag reserves in het ontwikkelen en volwassen oliehoudende zaden zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genexpressieprofielen bijdragen aan ons begrip van plantenfysiologie; Daarom zijn specifieke RNA isolatiemethoden ontwikkeld voor elk monster staat 9-12. Onderzochten we de processen die tijdens de RNA-isolatie werden geremd uit zaden en vond dat RNA binding aan silica membranen was ernstig geremd. Grote hoeveelheden olie, eiwitten en polyfenolen remmen RNA-isolatie. We pasten de RNA-extractiewerkwijze om deze verbindingen te verwijderen met een lysisoplossing voor het proces van RNA binding aan silica membra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken het personeel van Functional Genomics Facility en spectrografie en Bio-imaging Facility, Nibb Core Onderzoeksfaciliteiten en Model Plant Research Facility, Nibb Bioresource Center.
Materials
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
