Эффективный метод для выделения высокоочищенного РНК из семян для использования в количественном анализе Транскриптом
Summary
We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.
Abstract
Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.
Introduction
Растения производят семена, которые дают начало следующему поколению. Семена скапливаются большие объемы запасов хранения, таких как масла, углеводов и белков, для пост-герминативных роста. Люди используют семенные запасы хранения в качестве источника питания и кормов для животных, и, таким образом, семена растений являются одним из основных поставщиков пищевого органического вещества по всему миру. Увеличение урожайности семян является важной задачей в растительном науке.
Поскольку запасы хранения семян являются коммерчески ценным источником пищевых и промышленных материалов, молекулярные механизмы , лежащие в основе регуляции метаболизма этих запасов были широко исследованы 1-6. Далее выяснении эти механизмы будут полезны для повышения урожайности семян сельскохозяйственных культур. Семена развиваются в растительных яичниках после оплодотворения, и они созревают через ряд стадий развития 1,6,7. Дальнейшее развитие понимания молекулярного механизма, лежащего семян требует подробное, Точные профили экспрессии генов из ряда развивающихся семенах будет производиться. Тем не менее, высокие количества масла, белков, углеводов и полифенолов в семенах растений, делают его трудно выделить высокоочищенного РНК, что исключает возможность точного профилирование экспрессии генов.
Здесь мы вводим эффективный метод выделения РНК из семян масличных культур, содержащих большое количество масел, белков и полифенолов. Используя этот метод, исследователи смогут подготовить высокоочищенного РНК. Такая РНК будет полезна для мониторинга изменений в транскрипционные ключевых генов, контролирующих метаболический регулирование запасов хранения семян в развивающихся и зрелых семян масличных культур.
Protocol
Representative Results
Discussion
профили экспрессии генов способствуют нашему пониманию физиологии растений; Поэтому, методами выделения специфической РНК, были разработаны для каждого образца состояния 9-12. Мы исследовали процессы, которые были заторможены в процессе выделения РНК из семян и обнаружили, что Р?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим сотрудников фонда функциональной геномики и спектрографирование и биоимиджинга фонда, NIBB Основные научно-исследовательских учреждений, а также модель исследовательского фонда растений, NIBB центр биоресурсов.
Materials
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
