Co-localisatie van Cell Lineage Markers en de tomaat Signal
Summary
Wij ontwikkelden twee traceren combinaties Rosa26 tdtomato (alomtegenwoordig tot expressie in alle cellen) / Cre (specifiek tot expressie in chondrocyten) muizen: één met 2.3Col1a1-GFP (specifiek voor osteoblasten) en een met immunofluorescentie (specifiek voor botcellen). De gegevens tonen de directe omzetting van chondrocyten in botcellen.
Abstract
De cel lineage tracing systeem is voornamelijk gebruikt in ontwikkelingsbiologie studies. Het gebruik van Cre recombinase maakt de activering van de reporter in een specifieke cellijn en al het nageslacht. Hier hebben we gebruik gemaakt van de cel lineage tracing techniek aan te tonen dat chondrocyten direct in osteoblasten en osteocyten transformeren tijdens lange botten en kaakkopje ontwikkeling met behulp van twee soorten Cre, Col10a1-Cre en aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), gekruist met Rosa26 tdTomato. Zowel Col10 en aggrecan zijn goed herkend markers voor chondrocyten.
Op basis hiervan hebben we een nieuwe methode-cellijn tracing in combinatie met fluorescerende immunohistochemie te definiëren lot van de cel door het analyseren van de expressie van specifieke celmarkers. Runx2 (een marker voor een vroeg stadium osteogene cellen) en Dentin matrix protein1 (DMP1, een marker voor een laat stadium osteogene cellen) warengebruikt om chondrocyte afgeleide botcellen en hun differentiatie status identificeren. Deze combinatie verbreedt niet alleen de toepassing van cellijn tracing, maar vereenvoudigt ook de vorming van verbinding muizen. Belangrijker is het aantal, de locatie en differentiatie status van oudercel nageslacht gelijktijdig worden weergegeven, die meer informatie dan alleen cellijn tracing. Kortom, de co-toepassing van cellijn tracing technieken en immunofluorescentie is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van celbiologie in vivo.
Introduction
Tijdens de ontwikkeling endochondrale botvorming goed voor meer dan 80% van het skelet volume. Het wordt algemeen aangenomen dat het begint met de apoptose van hypertrofische chondrocyten. Vervolgens worden de cellen van het onderliggende beenmerg invasie en angiogenese initiëren, gevolgd door afzetting van nieuw bot beenmerg en periosteum-afgeleide cellen 1,2. Het lot van de cel van hypertrofische chondrocyten (HC), echter, is een kwestie van debat voor decennia 3. Aanvankelijk werden HC's als het einde van de chondrocyte differentiatieomzettingsweg zijn en apoptose werd algemeen aangenomen dat het uiteindelijke lot van HC zijn. Nu sommige onderzoekers suggereren dat ten minste enkele HCs kunnen overleven en bijdragen aan botvorming. Hoewel ze de groei voorgestelde plaat chondrocyten had de mogelijkheid om transdifferentiëren in osteoblasten basis van ultrastructuur, immunohistochemische kleuring en in vitro studies 46, geen van deze werkwijzen were definitief bij het aantonen van chondrocyte bijdrage aan de osteoblast lineage.
De cel lineage tracing techniek zorgt voor een meer rigoureuze manier om lot van de cel te bestuderen. Kort gesproken, een recombinase enzym dat alleen in een bepaald type cel tot expressie wordt gebracht, stimuleert de expressie van het reportergen. Zo worden dergelijke cellen en hun nakomelingen permanente etikettering 7. De Cre-loxP systeem wordt vaak gebruikt in lineage tracing. Cre (de recombinase enzym) zal de STOP sequentie tussen de twee loxP plaatsen accijnzen en activeer de verslaggever in een bepaalde cellijn (Figuur 1A). In sommige gevallen kan de onderzoeker kiezen een gunstig tijdstip te Cre activeren met een geneesmiddel, zoals tamoxifen, waardoor Cre te fuseren met een gewijzigde vorm van de oestrogeenreceptor (Cre ERT2) 8. TL-reporters hebben de standaard in lineage tracing experimenten omdat ze drastisch de complexiteit te verminderen gewordenen het verbeteren van de nauwkeurigheid en efficiëntie van de cel lot traceren 8,9. tdTomato is steeds de beste keuze onder de tl-reporters omdat het de helderste fluorescerend eiwit en de sterkste epifluorescentie, waardoor het gemakkelijk gevisualiseerd 7 (Figuur 1A).
Via de Rosa26 tdTomato lineage tracing, onze fractie en andere onderzoekers hebben aangetoond dat HC fenotype in botcellen tijdens de ontwikkeling 10-14 kunnen veranderen. Om dit te bereiken, hebben wij twee traceren combinaties met Rosa26 tdtomato (alomtegenwoordige expressie in alle cellen) / Cre (specifiek voor chondrocyten) muizen: 2.3Col1a1-GFP (specifiek voor osteoblasten) en immunofluorescentie (specifiek voor botcellen). De gegevens tonen dat beide methoden levensvatbaar manieren lot van de cel te bestuderen in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Door de technologische beperkingen, is het altijd moeilijk om het gedrag van cellen in vivo te onderzoeken. Echter, de cellijn tracing techniek blijkt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van celbiologie 7-9 zijn. In deze studie hebben we verder verbeteren dit protocol door het te combineren met immunofluorescentie. Zo kunnen lot van de cel worden gedefinieerd door meerdere gerelateerde markers, die de toepassing van lineage tracing verbreedt. Bovendien is deze co-lokalisatie van immunofluores…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. Lineage-tracing methods and the kidney. Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al. Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes. Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?. Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?. Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
