We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.
The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.
الهيكل العظمي هو جهاز معقد للغاية، ودينامية ومعقد يحتوي على مجموعة من الوظائف التي تمتد من الحركة، إلى التوازن الأيوني. تتألف من العظام والغضاريف، والهيكل العظمي يتكون من السكان خلية متميزة وظيفيا والتي تعمل للحفاظ على انها الهيكلية، والكيمياء الحيوية والميكانيكية النزاهة 1. واحدة من المهام الرئيسية للهيكل عظمي هو دورها في التنمية والنمو. تتطلب هذه العمليات تزامن السكان الخلوية المتعددة التي يتم تنظيمها من خلال الغدد الصماء ضيق والتحكم الجيني.
باستثناء عظام مسطحة مثل لوح الكتف، الجمجمة والقص، ويتكون الهيكل العظمي الثدييات من خلال عملية تعرف باسم التعظم غضروفي. هذه العملية، تنظم كل من جزيئيا ومكانيا، ويبدأ مع التكثيف من خلايا اللحمة المتوسطة المستمدة أساسا من الأديم المتوسط 2. تحت تأثير عامل SOX9 النسخ، والخلايا في الالبريد الداخلية من تكثفات تفرق في غضروفية، معربا عن وإفراز الغضروف المصفوفة خارج الخلية (ECM) مكونات محددة مثل النوع الثاني من الكولاجين وaggrecan. خلايا على هامش التكثيف، تعبر عن النوع الأول من الكولاجين وتشكيل سمحاق الغضروف، ترسيم العظام المحتملين 3. وفي وقت لاحق، وosteoprogenitors من سمحاق الغضروف تفرق في الخلايا بانية العظم، من إخراج التعبير عن عوامل النسخ، Runx2 وosterix 4. وهذا يؤدي إلى غلبة بانيات وتتم إعادة تسمية هذه الطبقة السمحاق الذي يشكل طوق عظمي المعادن في جميع أنحاء منتصف القسم من العظام. اختراق الأوعية الدموية في غشاء العظم وغزو السقالة الغضروفية يحدث تجلب معها، تستمد haematopoetically العظام resorbing الخلايا الآكلة، الذي يرتشف بقايا خلية غضروفية والكثير من مصفوفة الغضروفية 5. ملء الفراغات التي شكلتها osteoprogenitors مما أدى إلى التحجر الأساسيالمركز الذي يحتل تدريجيا جوهر diaphysis ويدمج مع السمحاق. خلايا أخرى تؤدي إلى نخاع العظام. حول الولادة، والأوعية الدموية وosteoprogenitors اختراق الغضروف مصفوفة الغنية في أي من الجانبين (الكردوس) من diaphysis النامية لتشكيل مركز التعظم الثانوي. تقع بين الكردوس وdiaphysis إما في نهاية العظام الطويلة هي الفرقة الغضروف – لوحة epiphyseal النمو – والتي هي المسؤولة عن تنسيق النمو الخطي من جميع العظام الطويلة (6).
غضروفية داخل لوحة النمو في البداية تتكاثر وتتطور في وقت لاحق من خلال مناطق متميزة شكليا، بتنسيق من التعبير متتابعة من عوامل النسخ والنمو. وتتويجا لهذه السلسلة من الأحداث هو الخروج من دورة الخلية وتضخم في غضروفية في وسط هذه السلائف الغضروف. غضروفية الضخامي تعبر بقوة نوع X الكولاجين والفلزي مصفوفة-13 (MMP13) والتي كبيرا توسيع حجم في اتجاه النمو الطولي تقدم أكبر مساهمة في نمو العظام في الثدييات 7،8. وعلاوة على ذلك، غضروفية الضخامي يتمعدن ECM المحيط بهم من خلال الافراج عن حويصلات مصفوفة، متخصصة غشاء يحدها هياكل لإنتاج فوسفات الكالسيوم غير المتبلور من خلال إدراجها من فوسفاتاز (الأنسجة غير محددة الفوسفاتيز القلوية (TNAP) وPHOSPHO1) والكالسيوم توجيه البروتينات (annexins ) 9-11. وغزت هذه الغضاريف متكلسة بواسطة الأوعية الدموية من نخاع الأساسي مما أدى إلى تجنيد ناقضة العظم وارتشاف المصفوفة. ويعقب ذلك الهجرة بناء العظم والمواءمة إلى السطح من بقايا الغضروف متكلسة حيث وضع طبقة من عظماني وهو المتمعدنة بسرعة. وتشكيلها العظام المنسوجة من الإسفنجي الأولية في وقت لاحق إلى العظام رقائقي من الإسفنجي الثانوية 12. النتائج الانصهار المشاشية فيوقف التحجر غضروفي 13.
التعظم داخل الغضروف تحت تنظيم محكم من قبل العديد من الغدد الصماء ونظير الصماوي الهرمونات وعوامل النمو وذلك لمنع تطوير بالانزعاج و / أو نمو العظام الطولية 14. فهم أفضل للآليات الجزيئية والخلوية التي تقوم عليها هذه العمليات وبالتالي من الضروري في سعينا لتحقيق التقدم السريرية نحو مصلحة الإنسان. وكانت دراسات سابقة إلى أوجه الشبه والاختلاف بين لوحات النمو من مختلف الأعمار والمواقع والأنواع قد تحسنت بشكل كبير من فهمنا للآليات الفيزيولوجية المحيطة ديناميات النمو لوحة 15،16. ومع ذلك، فإن دراسة غضروفية المعزولة صعبة، وإزالة غضروفية من بيئتهم يمكن أن يؤدي إلى فقد التمايز، يرافقه فقدان التعبير عن علامات رئيسية مثل Col2a1 17.
الماوس مشط القدم الجهاز ثقافة يزدرع، بيoneered البروفيسور إليزابيث برغر والزملاء في هولندا، هو خارج الجسم الحي نموذج الفسيولوجية للغاية لدراسة التحجر غضروفي ونمو العظام ومعدل نمو العظام في الثقافة تحاكي تلك التي شوهدت في الجسم الحي 18. فريد والثقافة الجهاز المشط يسمح للفحص غضروفية في مراحل مختلفة من الغضروف ويحافظ على خلية خلية والتفاعلات خلية مصفوفة، وبالتالي توفير ظروف أقرب إلى الوضع في الجسم الحي من الخلايا في الثقافة 19-21. وعلاوة على ذلك، هذا النموذج يسمح للفحص المباشر لنمو العظام الطولية والتي لم يكن ممكنا في الثقافات خلية غضروفية الأولية. كما يسمح لفصل العوامل النظامية والمحلية وبالتالي السماح لتحليل محدد للآثار المحلية على لوحة النمو.
ثقافة الأمشاط تتيح للتحقيق في العديد من المعلمات. القياسات اليومية من الطول الكلي والمناطق المعدنية لللا يمكن أن يؤديها اساسيات مع معيار المجهر مرحلة التباين وبرمجيات تحليل الصور. النسيجي، في التهجين وتلطيخ immunohistological يمكن أداؤها بسهولة على أقسام مشط القدم، والذي يسمح للقرار المكاني لكلا الكيانين الخلوية والجزيئية، وهي ميزة كبيرة على طرق زراعة الخلايا التقليدية. ويشمل النهج المناعى للكشف والقياس من 5 برومو-2'-deoxyuridine (BrdU) امتصاص المتكاثرة غضروفية 22. بالإضافة إلى ذلك، قد يتم تنفيذ مزيد من المعالجة من الأنسجة مشط القدم للسماح لتحليل المصب التعبير مرنا (RT-QPCR) والبروتين وتحليل الخلايا الإشارات (النشاف الغربي) أو تكوين الدهون (مطياف الكتلة). معظم الدراسات حتى الآن استخدام الأمشاط الجنينية مثقف بدلا من الأمشاط من الحيوانات بعد الولادة. بينما كلا النموذجين يمكن أن يكون بالمعلومات، ودراسة العظام الجنينية لديها العديد من المزايا: أنها تنمو بشكل أسرع ويمكن أن تكون EXPLOited لدراسة بدء وتطور من 23-25 عملية تمعدن.
يصف هذا البروتوكول بالتفصيل تشريح المعقد لالأمشاط الجنينية من أطرافهم هند من اليوم الجنينية 15 (E15) أجنة الفئران. وعلاوة على ذلك، يظهر النمو وتمعدن الأمشاط مميزة تشريحيا.
ثقافة الأمشاط الجنينية في الفئران يقدم نموذجا الفسيولوجية للغاية من النمو غضروفي وتمعدن. والتحقق من صحة الدراسات المبكرة التي E15 الأمشاط الماوس الخضوع لالنمط العادي للنمو الهيكل العظمي والتمايز. الغضروف (غضروفية) والعظام (بانيات والآكلة) الخلايا والمصفوفات الكولاجينية كل منهما لا يمكن تمييزها عن تلك التي لوحظت في الجسم الحي. ومع ذلك، هناك بعض القيود المعترف بها من هذا النموذج. هو ضعف سرعة التمايز ناقضة العظم كما هو نمو العظام (ولكن ليس الغضروف التمايز). نمو العظام أبطأ ما يقرب من 50٪ من تلك التي لوحظت في الجسم الحي، وربما يرجع ذلك إلى قصور في العوامل النظامية التي تؤثر على إنتاج عوامل محلية (على سبيل المثال، IGF-1، أفضل الممارسات الإدارية، وما إلى ذلك) (31). أيضا، فمن المسلم به أيضا أن العظام هي حساسة لبيئتها الميكانيكية وهذا هو الحال بالنسبة لالأمشاط مثقف، التي تستجيب لج أيضاhanges في 32،33 تحميل الميكانيكية. لذلك، في حالات المفرغة، كما هو موضح في هذا البروتوكول، تمعدن وارتشاف المعدنية يجوز المساس بها. ومع ذلك، فإن نموذج مشط القدم يوفر القدرة على قياس مباشرة نمو العظام الطولية والتي لم يكن ممكنا عبر 2D و 3D في نظم الاستزراع المختبر.
قدمنا وصفا شاملا لبروتوكول المشاركة في تشريح وثقافة E15 الأمشاط الفئران وبالفعل، للمرة الأولى، تأكد من صحة تجميع الثانية 2، 3 و 4 تشرين الأمشاط لإجراء التجارب.
يتم استخدام الأمشاط من E17 / E18 عادة للتحقيق في آليات نمو العظام نظرا لإمكاناتها غير عادية لتنمو خارج الجسم لفترات طويلة من الزمن (أي بعد 14 أيام في الثقافة). إنها نمط راسخة للتحقيق في دور عوامل النمو على نمو العظام الطولية الجنينية.بالإضافة إلى ذلك، تشريح وثقافة الأمشاط بعد الولادة ويعملون عادة لتحديد آليات المحيطة نمو العظام بعد الولادة كما أنه من المفهوم أن نمو العظام بعد الولادة ونمو العظام الجنين وينظم بشكل مختلف 21. نمو العظام التي لوحظت في الأمشاط بعد الولادة مثقف هو إلا أقل بكثير من تلك التي لوحظت في أساسيات جنينية 25،34، مما يحد من قدرتها في دراسات على المدى الطويل وتسليط الضوء على تأثير أكثر النظامية على نمو العظام في هذه المرحلة ما بعد الولادة. في الواقع، لمدة 3 أيام بعد الولادة الأمشاط القديمة من الفئران عادة ما تكون المرحلة الأخيرة التي يمكن استخدامها للحصول على 34 نمو قابلة للقياس.
نحن هنا وصف بروتوكول لدينا لعزل عظام مشط القدم الجنينية في E15. غياب المعدنية hydroxyapaptite في عظام مشط القدم E15 يعني أنها توفر نموذجا لا مثيل لها للتحقيق ليس فقط على آليات المحيطة نمو العظام الطولية، ولكن أيضا على بدءتمعدن الهيكل العظمي. المصفوفة المعدنية في المنطقة خلية غضروفية الضخامي المحطة توفر سقالة لغزو بانيات لوضع العظام مصفوفة محددة (عظمية) وهو المتمعدنة في وقت لاحق، وعلى هذا النحو هذا تمعدن أولي أمر حيوي لتكوين ناجح وظيفية العظام 35. في الواقع لقد أكدت عدد من التقارير الأخيرة استخدام الأمشاط E15 قدرتها الفريدة للتحقيق في 28،36،37 عملية تمعدن. وبالإضافة إلى ذلك، ووصف الباحثون استخدام الأمشاط E15 كنموذج للتكوين الأوعية الدموية 38، وتسليط الضوء على إمكانات الأمشاط الجنينية كنموذج خارج وضع العظام النمو / تمعدن.
البروتوكول وصفنا يتطلب سوى معدات المختبرات القياسية بما في ذلك غطاء الصفحي التدفق، ومجهر تشريح لأداء التشريح، وحاضنة CO 2 لثقافة اساسيات رفعه. وعلاوة على ذلك، طريق مسدود أساسية جداتلح تحتوي على المتوسط αMEM، BSA، والمضادات الحيوية، antimycotics وحمض L-الاسكوربيك (لكونه عامل مساعد في تركيب هيدروكسي وهيدروكسي ليزين، اثنين من الأحماض الأمينية الأساسية لإنتاج الكولاجين 39) الابتعاد عن استخدام المواد المضافة غير محددة، مثل الأمصال الحيوانية . تقليديا، واضاف المحققين βGP إلى وسائل الإعلام المستخدمة لثقافة الأمشاط الجنينية ولكن كما كشفت في نتائجنا، لا يلزم استخدام مصدر الفوسفات إضافية لتمعدن ناجحة في هذا النظام الثقافة. هذا اكتشاف مهم في سعينا لفهم الآليات التي تقوم عليها ECM تمعدن.
سبق إصابة الأمشاط مع الفيروسات الغدية التي تحتوي على الأشكال السائدة سلبية من Smad2 لاستكشاف دور عامل النمو المحول β في تنظيم نمو العظام الطويلة 40. هنا نحن تكشف أيضا عن ترنسفكأيشن ناجحة من النوع البري عظام مشط القدم E15 مع جزيئات الفيروس GFP، مشيرا ريمكن بسهولة اعتمدت تقنيات قبعة lentiviral للتلاعب التعبير الجيني في الثقافات مشط القدم. وبالمثل، فإن نظام الثقافة الجهاز مشط القدم هو نموذج ممتاز في لمقارنة نمو العظام من الفئران المعدلة وراثيا إلى فهم أفضل لدور جين معين في عملية نمو العظام. وقد استخدمت دراساتنا السابقة للنظام الثقافة الجهاز مشط القدم لتحديد دور القامع خلوى يشير 2 (SOCS2) في نمو العظام غضروفي. استخدام عظام المشط من الفئران من نقص في SOCS2، ونحن قد أظهرت أن هرمون النمو قادرة على محاكاة مستقلة نموها الطولي للأنسولين مثل عامل النمو (IGF-1)، على عكس النوع البري عظام مشط القدم التي لا تستجيب للهرمون النمو علاج 34، 41. هذا يسلط الضوء على مدى الثقافات مشط القدم يمكن التلاعب بها لدراسة آثار جينات مختلفة و / أو عوامل خارجية على نمو العظام غضروفي.
باختصار، لدينا التفصيلقاد طريقة لاستخراج ناجحة وثقافة عظام مشط القدم الجنينية التي يمكن التلاعب بها وفحصها باستخدام مجموعة متنوعة من التحليلات. يحافظ هذا فيفو السابقين نموذج خلية خلية والتفاعلات خلية مصفوفة، وكذلك يحتوي على غضروفية في مراحل مختلفة من الغضروف، وبالتالي توفير نموذج أكثر الفسيولوجية من الخلايا في أحادي الطبقة أو الثقافة 3D. لذا مشط القدم الثقافات الجهاز هي نموذج فريد للتحقيق في الآليات الجزيئية المسؤولة عن التحجر غضروفي، وضرورية لزيادة فهمنا للعلم وظائف الأعضاء على حد سواء العظام والفيزيولوجيا المرضية
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
Syringe filters (0.22μm) 33mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20°C |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20°C |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20°C |
Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |