전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성
Summary
Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.
Abstract
Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.
Introduction
수지상 세포 (DCS)는 우리의 면역 시스템의 중요한 전문 항원 제시 세포이다. 미성숙 수지상 세포 (이 iDCs)는 피부 또는 점막 조직에 상주하며 침입 병원체와 상호 작용하는 제 면역 세포 중에서 따라서이다. 그들은 병원체 검출 이후에 T-와 B 세포 반응을 활성화 할 수 있기 때문에 수지상 세포는 선천성 및 적응성 면역 체계 1 사이의 다리를 나타냅니다. 또한, 그들은 때문에 이러한 IL-1β, IL-6, IL-12 사이토 카인의 다량의 분비 염증성 면역 반응에 기여한다. 수지상 세포는 NK 세포의 활성화 및 주 화성에 의한 감염 부위에 다른 면역 세포를 끈다.
미성숙 수지상 세포는 수지상 세포 (이 iDCs) 및 형태와 기능에 기초하여 성숙 수지상 세포 (MDCS) 2로 나누어 질 수있다. 많은 패턴 인식 수용체의 하나 (예를 들어, 수신자 같은 수용체, C 형에 의한 외국 항원의 인식 후렉틴 또는 다량 세포 표면에 발현) 수용체를 보완이 iDCs는 큰 변화를 겪는 성숙한 시작한다. 항원 제시에 필수적인 분자가 3 상향 조정되는 반면이 성숙 과정에서, 항원 캡처 수용체는, 아래로 조절된다. 성숙한 DC가 주요 조직 적합성 복합체 I 및 II (MHC I과 II)를 상향 조절, T 림프구의 항원 제시 및 활성화에 필수적인 CD80 및 CD86와 같은 공동 자극 분자. 또한, 세포 표면의 케모카인 수용체 CCR7의 발현은 림프절 말초 조직에서 수지상 세포의 이동을 가능하게하는 유도된다. 마이그레이션은 림프절 4-6로 케모카인 리간드 19 (CCL19 / MIP-3B)과 케모카인 리간드 21 (CCL21 / SLC) 그라데이션을 따라 수지상의 "구름"에 의해 촉진된다.
마이그레이션 후, MDC에 따라서 INI, CD4 +와 CD8 + T 세포를 순진하기 위해 처리 된 항원을 제시침입 병원균 7에 대한 적응 면역 반응을 tiating. 림프절에서 T 세포와의 상호 작용이도 8 바이러스의 확산과 관련된다. 다른 시험관 연구는 DC가 효율적으로 캡처하고 활발한 감염 9-12이 전송 결과 T 세포 것을 HIV를 전송하는 것으로 나타났습니다. 이 실험은 림프절에 주변에서 셔틀로 그 생체 내 HIV의 공격의 수지상를 강조 표시합니다. 항원 제시 중에 DCS는 이펙터 T 헬퍼 세포의 분화를 형성하고, 따라서, 미생물에 대한 전체 면역 반응의 결과가이 상호 작용에서 매우 중요한 판단 인터루킨 분비. 별도로 1 형 (받은 Th1)과 제 2 형에서 (TH2) 이펙터 T 세포, CD4 + T 헬퍼 세포 (예를 들어, 유형 17 (Th17) 및 유형 22 (Th22) T 세포)에 설명 된 다른 부분 집합, 그들의 유도 기능은 충분히 조사하고있다. 수지상은 또한에 관여T 조절 세포 (Tregs) (13, 14)의 생성. 이 세포들은 면역 억제하고 중지하거나 또는 유도 이펙터 T 세포의 증식을 하향 조절함으로써 면역 관용 개발 중요하다 할 수있다.
인간 기존의 DC (CDCS)는 골수 기원 세포의 여러 하위 집합을 포함한다 (즉, 랑게르한스 세포 (LCS)과 피부 및 간질 DC가) 또는 림프 기원 (즉, 형질 DC가 (올라가고)). 시험 관내 실험 또는 DC 예방 접종 전략의 경우, 단핵구 유래 수지상 정기적으로 피부 수지상의 모델로 사용된다. 이 세포들은 기존의 골수 수지상 세포 생리학, 형태 및 기능의 유사성을 보여줍니다. 이들은 건강한 공여자로부터 단리 12,15-18 단핵구에 인터루킨 4 (IL-4), 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)의 첨가에 의해 생성된다. 수지상 세포는 또한 직접적으로 피부 또는 점막 생검으로부터 분리, 또는 B 수 가능E는 CD34 + 전 자궁 획득 탯줄 혈액에서 분리 한 조혈 전구 세포에서 개발 하였다. 여기서는 단핵구 절연 및 밀도 구배 원심 분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 농축 한 후 항 – 인간 혈액 응고 촉진하는 방법을 보여준다. 5 일간 배양 한 후, 특정 조건 하에서 인간 단핵 세포는이 iDCs로 분화하고 비 임상 설정에서 실험 절차에 대한 준비가되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 자성 나노 입자 – 기반 분석법을 이용하여 항 – 응고 혈 단핵 세포에서 인간의 분리를 통하여 단핵 세포 – 유래 수지상 세포 (MDDCs)의 생성을 설명한다. 이 프로토콜에서, 원심 분리 단계는 PBMC의 분획의 농축에 이르는 세포 분리 과정 상류 행한다. 세포를 원심 분리 중에 손실되지만, 밀도 구배 배지 200-300 ml의 요구 밀도 구배 매체의 전혈 팩의 내용을 오버레이 때문에 비용 효율적으?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies Mühlbacher and Dr. Paul Hörtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).
Materials
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10mL Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25mL Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | — | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10X) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1,5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
References
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