דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא
Summary
Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.
Abstract
Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.
Introduction
תאי דנדריטים (DCS) הם תאי מציגי אנטיגן המקצועיים החשובים ביותר של מערכת החיסון שלנו. בשלה DCS (iDCs) מתגוררת בעור או ברקמות ריריות ולכן הם בין תאי מערכת החיסון הראשונים אינטראקציה עם פתוגנים פולשים. DCs לייצג את הגשר בין מולד במערכת החיסונית אדפטיבית 1, שכן הם יכולים להפעיל T- ו- B-cell מהתשובות הבאות זיהוי הפתוגן. יתר על כן, הם תורמים תגובות פרו-דלקתיות חיסוניות בגלל הפרשת כמויות גבוהות של ציטוקינים, כגון IL-1β, IL-6, IL-12. DCs גם להפעיל תאי NK ולמשוך תאי חיסון אחרים לאתר של זיהום על ידי chemotaxis.
DCs ניתן לחלק תאים דנדריטים בשלים (iDCs) ותאים דנדריטיים בוגרים (mDCs) 2 מבוסס על מורפולוגיה ותפקודם. לאחר ההכרה של אנטיגנים זרים על ידי אחד הקולטנים זיהוי דפוסים רבים (למשל, קולטנים דמוי אגרה, C-typeלקטינים, או משלימים קולטנים) מבוטא בשפע על פני התא, iDCs עוברים שינויים גדולים מתחילים להבשיל. במהלך תהליך התבגרות זה, קולטנים ללכוד אנטיגן למטה מוסדרים, ואילו מולקולות חיוניות מצגת אנטיגן למעלה מוסדרות 3. בוגר DCs עד להסדיר את מתחמי histocompatibility הגדולות I ו- II (MHC I ו- II), מולקולות גירוי שיתוף כמו CD80 ו CD86, שחיוניים מצגת אנטיגן והפעלה של לימפוציטים מסוג T. בנוסף, הביטוי של CCR7 הקולטן chemokine על פני התא מושרה, המאפשרת הגירה של DCs מרקמות הפריפריה אל קשרי הלימפה. ההגירה הוא הקל על ידי "גלגול" של DCs יחד ליגנד chemokine 19 (CCL19 / MIP-3B) ו -21 ליגנד chemokine (CCL21 / SLC) שיפוע לבלוטות הלימפה 4-6.
בעקבות הגירה, mDCs להציג אנטיגן מעובד כדי נאיבי CD4 + ו- CD8 + T תאים, ובכך initiating תגובה חיסונית אדפטיבית נגד הפתוגן הפולש 7. אינטראקציה זו עם תאי T של בלוטות הלימפה קשורה גם עם התפשטות הנגיף 8. מחקרים אחרים במבחנה גילו כי DCs ביעילות ללכוד ולהעביר HIV לתאי T וכי תוצאות שידור זה זיהום נמרץ 9-12. ניסויים אלו מדגישים כי DCs מנצל in vivo HIV כמו הסעות מהפריפריה אל קשרי הלימפה. במהלך מצגת אנטיגן, DCS להפריש אינטרלויקנים מפתח המעצבים את ההתמיינות של תאי עוזר מפעיל T, ולכן, התוצאה של התגובה החיסונית כולה נגד החיידק נקבעה אינטראקציה מאוד זה. מלבד סוג 1 (Th1) וסוג 2 (Th2) מפעיל תאי T, תת אחרים של התאים המסייעים CD4 + T (למשל, סוג 17 (TH17) וסוג 22 (Th22) תאי T) תוארו, ואינדוקציה שלהם פונקציה נחקרה ביסודיות. DCs יתר מעורביםהדור של תאי T רגולטוריים (Tregs) 13,14. תאים אלה הם אימונוסופרסיבי ויכולים להפסיק או למטה להסדיר אינדוקציה או התפשטות של תאי T מפעיל ועל כן הם חיוניים לפיתוח חסינות וסובלנות.
DCs קונבנציונאלי האדם (cDCs) המורכבים מכמה תת קבוצות של תאים עם ממוצא מיאלואידית (כלומר, תאים לנגרהנס (LCS) ואת עורי DCs ביניים) או ממוצא הלימפה (כלומר, DCs plasmacytoid (PDC)). בניסויים במבחנה או אסטרטגיות חיסון DC, DCS-derived מונוציטים משמש באופן שגרתי כמודל DCs העור. תאים אלו מראים דמיון בפיזיולוגיה, מורפולוגיה, ותפקוד התאים הדנדריטים מיאלואידית קונבנציונאלי. הם מופקים על ידי תוספת של interleukin 4 (IL-4) ו גרנולוציט-מקרופאג גורם מגרה המושבה (GM-CSF) כדי מונוציטים מבודד מתורמים בריאים 12,15-18. תאי דנדריטים יכולים גם להיות מבודדים ישירות ביופסיות עורי או ברירית, או יכולים אפילו בדואר התפתח CD34 + ובתאי hematopoietic המבודדים דגימות דם חבל הטבור השיגו ברחם לשעבר. הנה, אנחנו מדגימים איך מונוציטים מבודדות מגורה מדם אדם אנטי-קרוש לאחר תא דם היקפיים mononuclear (PBMC) והעשרה על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. לאחר הדגירה במשך 5 ימים, מונוציטים אדם בתנאים מסוימים הם מובחן לתוך iDCs והם מוכנים פרוצדורות בסביבה הלא-קלינית.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את הדור של תאים דנדריטים הנגזרות מונוציטים (MDDCs) דרך הבידוד של מונוציטים האדם מדם קרוש אנטי באמצעות assay מבוססי ננו-חלקיקים מגנטיים. בפרוטוקול זה, השלבים צנטריפוגה מבוצעים זרם הליך בידוד תא, מה שמוביל העשרת שבר PBMC. למרות שתאים הם אבדו במהלך צנטריפוג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies Mühlbacher and Dr. Paul Hörtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).
Materials
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10mL Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25mL Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | — | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10X) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1,5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
- Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
- Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
- Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
- Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
- Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
- McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
- Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
- Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
- Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
- Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
- Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891 (2010).
- Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, 1368-1374 (2012).
- Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005 (2015).
- Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
- Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).
