بروتوكول الأمثل لتحليل تحلل السكر والميتوكوندريا التنفس في الخلايا اللمفاوية
1Laboratory of Mitochondrial Biology and Metabolism, National Heart, Lung, and Blood Institute,National Institutes of Health, 2Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases,National Institutes of Health, 3Laboratory of Immunology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases,National Institutes of Health
Summary
The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.
Abstract
الخلايا الليمفاوية تستجيب لمجموعة متنوعة من المحفزات من خلال تفعيل مسارات الإشارات بين الخلايا، وهذا بدوره يؤدي إلى سرعة انتشار الخلوية، والهجرة، والتمايز، وإنتاج السيتوكينات. كل هذه الأحداث ترتبط ارتباطا وثيقا بحالة الطاقة للخلية، وبالتالي دراسة مسارات المنتجة للطاقة قد تعطي مؤشرات حول الوظائف العامة لهذه الخلايا. محلل تدفق خارج الخلية هو جهاز يستخدم عادة لتقييم أداء تحلل والتنفس الميتوكوندريا في العديد من أنواع الخلايا. وقد استخدم هذا النظام لدراسة الخلايا المناعية في عدد قليل من التقارير المنشورة، بعد بروتوكول شامل الأمثل خاصة بالنسبة لمفاوية غير متوفرة. الخلايا اللمفاوية هي الخلايا الهشة التي تعيش بشكل سيئ في ظروف خارج الحي. في كثير من الأحيان اللمفاويات فرعية نادرة، والعمل مع أرقام الهواتف المحمولة منخفضة أمر لا مفر منه. وبالتالي، مطلوب استراتيجية التجريبية التي تتناول هذه الصعوبات. هنا، ونحن نقدم بروتوكولالتي تسمح للعزلة السريع من الخلايا الليمفاوية قابلة للحياة من الأنسجة اللمفاوية، ولتحليل دولهم التمثيل الغذائي في محلل تدفق خارج الخلية. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم نتائج التجارب التي قارنت الأنشطة الأيضية لعدة أنواع فرعية لمفاوية بكثافات مختلفة من الخلايا. وتشير هذه الملاحظات أن بروتوكول لدينا يمكن استخدامها لتحقيق نتائج موحدة ومتفقة حتى بتركيزات منخفضة خلية، وبالتالي قد يكون لها تطبيقات واسعة في الدراسات المستقبلية التركيز على توصيف الأحداث الأيض في الخلايا المناعية.
Introduction
الاستجابة المناعية ضد المستضدات هي تحقيق توازن ينظم بإحكام بين تنشيط جهاز المناعة وضعف المناعة. تنشيط جهاز المناعة يدفع انتشار السريع الخلية والهجرة، وكذلك إنتاج السيتوكينات، إفراز الأجسام المضادة وزيادة البلعمة ردا على المنشطات، في حين قمع المناعة ببساطة يمنع هذه الأحداث ولذلك أمر مهم في منع الاستجابات المناعية غير الضرورية 1-6. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن وجود صلة مباشرة بين وجود حالة تنشيط الخلايا المناعية ونشاط مختلف المسارات الأيضية 7. الخلايا المناعية يمكن أن تحول بين الراحة والمفعلين الدول عن طريق التحول مسارات إنتاج الطاقة على نحو متقطع. وعلاوة على ذلك، فقد لوحظ أن أنواع مختلفة من الخلايا المناعية قد تستخدم استراتيجيات الأيض المختلفة لتعزيز زيادة احتياجاتها من الطاقة أثناء التنشيط. على سبيل المثال، في حين تفعيل الخلايا اللمفية تي يوجه الخلايا في دولة تقريبا حال السكر تماما 8 </suص>، الخلايا الليمفاوية B تنشيط تستخدم ميزان تحلل والفسفرة التأكسدية 9،10. وتشير هذه الدراسات إلى أهمية التحقيق في الآثار المترتبة على تنشيط الخلايا المناعية على الأيض الخلوي.
في الوقت الحقيقي، والقياسات في وقت واحد من معدل استهلاك الأكسجين (OCR) وخارج الخلية معدل حموضة (ECAR)، ومؤشرات الفسفرة التأكسدية وتحلل، هو استراتيجية مشتركة لمواجهة حالات مسارات إنتاج الطاقة 11-13. من أجل تحقيق هذا الهدف، محلل تدفق خارج الخلية، مثل فرس البحر XF 96، ويستخدم بشكل روتيني. مثل هذا الصك يمكن مقارنتها بسرعة التغيرات في التعرف الضوئي على الحروف وECAR عبر أنواع الخلايا أو على الظروف التحفيز المختلفة. وحتى الآن، مختلف أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا المناعية، وقد تم دراسة استخدام هذه الأجهزة. ومع ذلك، بروتوكول الأمثل مصممة خصيصا للخلايا المناعية غير متوفر.
الخلايا المناعية، وخاصة الخلايا اللمفية، تختلف عن بعد التمديدأنواع الخلايا لها في العديد من الطرق الحيوية. الخلايا اللمفاوية هي الخلايا الهشة التي لا البقاء على قيد الحياة لفترات طويلة في الجسم الحي السابقين الظروف 14-16. هذه قضية أكبر عندما تكون مثقف في وسائل الاعلام النمو الأمثل تفتقر إلى العناصر الغذائية الأساسية، مثل تلك المستخدمة في تحليل تدفق خارج الخلية. على عكس الضامة والعديد من خطوط الخلايا، الخلايا الليمفاوية لا تلتزم الأسطح البلاستيكية. لذا فمن الأهمية بمكان لضمها إلى لوحة التحليل دون توليد التوتر. وأخيرا، قد يكون بعض القطعان اللمفاويات نادرة للغاية وحصاد لهم في المطلوبة، وكميات الأمثل قد يكون تحديا 17-19.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول الأمثل التي تم تطويرها خصيصا لالخلايا الليمفاوية. باستخدام splenocytes، الخلايا الليمفاوية B وساذجة اللمفاويات CD4 + T معزولة من الطحال والغدد الليمفاوية الماوس 20، نقدم لك مجموعة من خصائص الدولة يستريح تحلل والفسفرة التأكسدية بهم في مختلفاكثافة الخلايا التائية. وكانت البيانات تطبيع لمراعاة الفروق في أعداد الخلايا الأولية لكل بئر من خلال قياس نهاية فحص الخلايا المحللة تركيزات البروتين، والتي كانت يتناسب طرديا مع أعداد الخلايا. بروتوكول لدينا ليس فقط يوفر المبادئ التوجيهية للعزلة السريع من الخلايا الليمفاوية قادرة على البقاء لفحوصات تدفق خارج الخلية، لكنه يسمح أيضا للعمل على تركيز خلية دون المستوى الأمثل من دون المساومة على جودة البيانات.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للبروتوكول الحيوان LIG-4، التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام NIAID الحيوان. 1. إعداد الكواشف إعداد عازلة المغناطيسي فصل (MS): برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.2) تستكمل مع 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA أو حل الانفصال التلقائي تستكمل مع 0.5٪ BSA. تصفية العقيمة (0.22 ميكرون) وتخزينها في 2-8 درجة مئوية. إعداد المتوسطة RF10: المتوسط 1640 RPMI تستكمل مع 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني، 50 U / البنسلين مل، 50 ميكرومتر الستربتومايسين، 1 ملم البيروفات الصوديوم، 2 مم L-الجلوتامين، 0.1 الأحماض الأمينية غير الأساسية مم، 50 ميكرومتر 2 -mercaptoethanol، 10 ملي HEPES. استخدام الكواشف معقمة. تصفية العقيمة وتخزينها في 2-8 درجة مئوية. إعداد الميتوكوندريا اختبار التحمل المتوسطة: متوسط قاعدة XF تستكمل مع 1 ملم البيروفات الصوديوم، 2 مم L-الجلوتامين و 25 ملي الجلوكوز. إعداد تحلل اختبار التحمل المتوسطة: التكميليه المتوسطة قاعدة XFتيد مع 2 مم L-الجلوتامين. ضبط درجة الحموضة من كل من الميتوكوندريا والإجهاد تحلل وسائل الاعلام الاختبار إلى 7.4، تصفية العقيمة وتخزينها في 2-8 درجة مئوية. وسائل الاعلام الحارة إلى 37 درجة مئوية، وإعادة ضبط درجة الحموضة قبل الاستخدام (إجراء قياسات درجة الحموضة عند 37 درجة مئوية). ملاحظة: استخدام XF المتوسطة، التي تفتقر إلى بيكربونات، أمر بالغ الأهمية. منذ الجو في محلل تدفق خارج الخلية يحتوي فقط CO المحيطة 2، أي بيكربونات في المتوسط، على ملزم لالبروتونات صدر كمنتج ثانوي للتحلل، وتنأى لتشكيل CO 2 والماء. CO 2 سوف ديغا أثناء التجربة، مما تسبب الانجرافات في درجة الحموضة التي من شأنها أن تحجب إشارة تحمض حال السكر. إعداد أوليغوميسين: إعداد 10 ملي حل الأسهم في DMSO. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية. إعداد 2،4-DNP: إعداد 1 M حل الأوراق المالية في DMSO. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية. إعداد أنتيمايسين إيه: إعداد 10 ملي حل الأسهم في DMSO. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية. إعداد روتينون: إعداد 10 ملم الصورةحل توك في DMSO. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية. إعداد الجلوكوز: حل الجلوكوز في المتوسط اختبار الإجهاد تحلل لتكوين محلول 250 ملم. إعداد الطازجة قبل كل تجربة ولا تجمد. إعداد 2-DG: حل الصلبة 2-DG في المتوسط اختبار الإجهاد تحلل لتكوين محلول 500 ملم. إعداد الطازجة قبل كل تجربة ولا تجمد. 2. حصاد الطحال والغدد الليمفاوية من الفئران الموت ببطء الماوس عن طريق CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم. رذاذ الفأر مع الايثانول 70٪. لاحقة عزل الخلايا التائية، حصاد الطحال، عنق الرحم سطحية، سطحية / إبطي عميق، الفك السفلي، الاربية، والغدد الليمفاوية المساريقي. لعزل الخلايا البائية لاحقة، الحصاد فقط الطحال. ملاحظة: استخدام الوزراء للسلامة الأحيائية والحفاظ على الأجهزة التي تحصد في برنامج تلفزيوني أو وسائل الإعلام RF10 على الجليد حتى المعالجة. استخدام معدات المختبرات معقمة وتقنية معقمة لجميع تجهيز وISOLخطوات أوجه. إبقاء جميع المخازن وسائل الإعلام على الجليد لزيادة كفاءة العزل وللحد من موت الخلايا. تجهيز 3. النسيج وضع مصفاة 70 ميكرومتر الخليوي أكثر من أنبوب مخروطي 50 مل ونقل الأجهزة على مصفاة. لتي العزلة الخلية، والجمع بين كافة أجهزة ولب نقل العزلة الخلية فقط الطحال. باستخدام المكبس من حقنة معقمة 3 مل، الهريس الأنسجة من خلال مصفاة. خلال يهرس، تأكد من أن مرشح والأجهزة ورطبة في جميع الأوقات، والرطب لهم على النحو المطلوب عن طريق إضافة عازلة MS. هذا على حد سواء حفاظ على بقاء الخلية عالية ومنع انسداد الفلتر. بعد يهرس، وتطبيق 5-10 مل MS العازلة للمرشح لزيادة الانتعاش الخلية. الطرد المركزي تعليق في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. (القيام بجميع centrifugations المزيد في ظل هذه الظروف، ما لم ينص). صب السائل و resuspend بيليه في 5 مل ACK الدم الحمراء عازلة خلية تحلل. Incuباتي لمدة 5 دقائق على الجليد لليز خلايا الدم الحمراء (يجب إزالة خلايا الدم الحمراء لأنها تتداخل مع الفصل المغناطيسي). إضافة 10-20 مل MS العازلة وأجهزة الطرد المركزي. وضع مرشح خلية 30 ميكرون أكثر من 15 مل أنبوب مخروطي ورئيس الوزراء مع 1 مل العازلة MS (هذا الترشيح سيتم إزالة الحطام من تحلل كرات الدم الحمراء). صب السائل من أنبوب طرد، resuspend الكرية في 5 مل MS العازلة وتمريرها من خلال مرشح. غسل أنبوب الأولي مع 4 مل MS عازلة لزيادة الانتعاش الخلية، واستخدام هذا لشطف التصفية. باستخدام عدادة الكريات أو عداد خلية الآلي، وتحديد العدد الكلي للخلايا. وسيتم استخدام هذا الرقم الخليوي لتحديد مقدار الكواشف الفصل المغناطيسية المطلوبة في القسم 4. إذا splenocytes هي لاستخدامها في فحص التدفق خارج الخلية لاحق، جانبا العدد المناسب من الخلايا في هذا الوقت. أجهزة الطرد المركزي لتعليق، والشروع في الفصل المغناطيسي. splenocytes و resuspend لم تستخدملعزل الخلايا البائية في 5 مل RF10 والحفاظ على الجليد حتى فحص تدفق خارج الخلية. 4. الفصل المغناطيسي للخلايا B وخلايا CD4 + T السذاجة تحديد الكميات اللازمة من كوكتيل البيوتين الأجسام المضادة، ميكروبيدات مكافحة البيوتين، وعازلة MS. استخدام وحدات التخزين التالية لمدة 10 8 خلايا كدليل وتوسيع نطاق أعلى أو لأسفل عند الضرورة. ملاحظة: احتضان العينات في الثلاجة بدلا من التركيز على الجليد منذ تفرخ على الجليد قد يقلل من كفاءة ملزم الأجسام المضادة، وربما تكون هناك حاجة مرات حضانة أطول. الكواشف لالسذاجة فصل خلايا CD4 + T حجم لمدة 10 8 خلايا (مقياس بشكل مناسب) كوكتيل البيوتين الأجسام المضادة 100 ميكرولتر عازلة MS للحضانة الأولى 400 ميكرولتر ميكروبيدات مكافحة البيوتين 200 ميكرولتر ميكروبيدات CD44 100 ميكرولتر عازلة MS للحضانة الثانية 200 ميكرولتر احتضان كوكتيل البيوتين الأجسام المضادة وخلايا في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة ميكروبيدات مكافحة البيوتين، ميكروبيدات CD44، MS العازلة واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. الجدول 1: أحجام عزل الخلايا التائية والتعليمات. الكواشف لفصل الخلايا البائية حجم لمدة 10 8 خلايا (مقياس بشكل مناسب) كوكتيل البيوتين الأجسام المضادة </td> 100 ميكرولتر عازلة MS للحضانة الأولى 400 ميكرولتر ميكروبيدات مكافحة البيوتين 200 ميكرولتر عازلة MS للحضانة الثانية 300 ميكرولتر احتضان كوكتيل البيوتين الأجسام المضادة وخلايا في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. إضافة الحجم المناسب للكوكتيل البيوتين الأجسام المضادة وعازلة MS، واحتضان الخليط في 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. إضافة حجم مناسب من ميكروبيدات مكافحة البيوتين وMS العازلة واحتضان الخليط في 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة الثانية، وملء الأنبوب مع العازلة MS وأجهزة الطرد المركزي. الجدول 2: الكميات عزل الخلايا البائية والتعليمات. Resuspend وبيليه في المخزن MS: 500 ميكرولتر لفصل اليدوي، 3-4 مل للانفصال التلقائي. تواصل مع أي فصل اليدوي أو الآليعلى النحو التالي: دليل الفصل: إدراج عمود LS إلى المغناطيس الانفصال، وضع العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل أدناه لجمع التدفق من خلال، ورئيس العمود عن طريق الغسيل مع 3 مل العازلة MS. تجاهل التدفق من خلال. نقل تعليق الخلية إلى العمود LS معبي والسماح لها بالمرور خلال؛ غسل أنبوب المستخدمة أثناء الحضانة مع 3 مل MS العازلة وتمرير ذلك من خلال عمود كذلك. سوف تحتوي على شطافة خلايا النقاء. لب زنزانة انفرادية، وتمرير خلايا النقاء من خلال عمود للمرة الثانية في أنبوب 15 مل الجديد، وكرر الخطوة الغسيل. سيؤدي هذا إلى زيادة نقاء والعائد. الفصل الآلي: التبديل على الفاصل التلقائي والتحقق من مستويات تشغيل العازلة، الشطف حل والايثانول 70٪. تأكد من أن النفايات فارغة قبل بدء الفصل. حدد رف المبرد المناسب اعتمادا على حجم أنبوب رانه نموذج غير المكرر (على سبيل المثال، 15 مل). من أجل الحفاظ على خلايا قابلة للحياة في جميع مراحل عملية الفصل، استخدام الرفوف التي وتأثرت سابقا في 2-8 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة، أو حتى يصبح المبرد الصلبة. جبل الرف المبردة على المسرح عينة من الفاصل التلقائي. وضع أنبوب العينة في فتحة A1، أنبوب لجزء سلبي في فتحة B1، وأنبوب لجزء إيجابي في C1. إذا جمع عينة أكثر من واحد، ووضع أنابيب إضافية في الأعمدة التالية (A2، B2، C2، وما إلى ذلك). حدد علامة التبويب الفاصل على الشاشة التي تعمل باللمس، وتشير إلى ترتيب الأنابيب على الرف. من القائمة الانفصال، حدد البرنامج "تستنزف" واستكمال دورة البرنامج مع النوع المناسب من غسل (انظر الملاحظة أدناه). ملاحظة: برنامج "تستنزف" ينفذ استنزاف باستخدام الوضع الأكثر حساسية في الجهاز، والتي تعطي الأولوية للنقاء. بالإضافة إلى ذلك، هناك ثلاثة خيارات غسل مختلفة: QUIC ك شطف، شطف، والنوم. إذا كانت العينات من نفس المصدر وهي لتكون جنبا إلى جنب، حدد شطف سريع. إذا كانت العينات إلى أن تبقى منفصلة، حدد الشطف. حدد الخيار النوم إذا كان سيتم إجراء أي العزلة المزيد من ذلك اليوم، وإذا كان سيتم إيقاف الجهاز بعد عزلة بدء العزلة عن طريق الضغط على "تشغيل"، وتأكيد مستويات عازلة عند المطالبة. بعد البرنامج قد انتهى، وجزء سلبي تحتوي على خلايا النقاء. ملء أنبوب يصل مخروطي إلى 15 مل مع MS العازلة وأجهزة الطرد المركزي. صب MS العازلة والخلايا resuspend في 5 مل سائل الإعلام RF10. تبقي الخلايا على الجليد حتى فحص تدفق خارج الخلية. ملاحظة: من الناحية المثالية، ينبغي إجراء فحص تدفق خارج الخلية على الفور بعد العزلة. ومع ذلك، في التجارب الأولية لوحظت فروق ذات دلالة إحصائية في نتائج الفحص في الخلايا المستخدمة في 3 ساعات من العزلة مقابل تلك المعزولة حديثا. <p class = "jove_title"> 5. خارج الخلية الجريان الفحص ملاحظة: بروتوكول المبين هنا هو للشكل 96-جيدا الصك. سوف تحتاج مجلدات لتعديلها إذا تم استخدام شكل آخر. ترطيب الاستشعار خرطوشة ارفع خرطوشة الاستشعار، وملء كل بئر من لوحة فائدة مع 200 ميكرولتر من حل calibrant وخفض خرطوشة استشعار على لوحة فائدة، غمر أجهزة الاستشعار في حل calibrant. ملاحظة: تحقق من أن مستوى حل calibrant مرتفع بما يكفي للحفاظ على أجهزة استشعار المغمورة. خرطوشة تؤوي fluorophores المرتبطة O 2 و H + لكل بئر. هذه تحتاج إلى رطب من أجل دفعهم للعمل بشكل صحيح. وضع خرطوشة في الحاضنة 37 درجة مئوية لا تستكمل مع CO 2 أو الأوكسجين / النيتروجين. تنفيذ جميع حضانات أخرى في ظل هذه الظروف، ما لم يذكر. احتضان خرطوشة بين عشية وضحاها لترطيب. Preparأوجه من لوحات مغلفة لاصق، إعداد 2.5 مل من 22.4 ميكروغرام / حل اللصق مل في 0.1 م بيكربونات الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0 (توفر بيكربونات درجة الحموضة المثلى لامتصاص المواد اللاصقة). تطبيق 25 ميكرولتر من حل كل بئر من لوحة الفحص، واحتضان على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. نضح لاصقة وغسل كل بئر مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من الماء المعقم. انتظر حتى آبار جافة قبل البذر الخلايا. بذر خلايا في لوحات المغلفة لاصق خلايا الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة في 200 x ج لمدة 5 دقائق. خلايا resuspend في 5 مل من وسيلة الفحص المناسب (انظر أعلاه لصياغة الإجهاد الميتوكوندريا وسائل الإعلام الإجهاد الجلوكوز). خلايا الطرد المركزي مرة أخرى و resuspend في تركيز المطلوب في فحص المتوسطة (سوف حجم إعادة تعليق تختلف بناء على التركيز، كل بئر سوف تحتوي على 180 ميكرولتر من تعليق خلية). ملاحظة: طالما أن وسائل الإعلام فحص المناسبة ومجمعتستخدم الصورة، محلل تدفق خارج الخلية يمكن تشغيل في وقت واحد الميتوكوندريا والإجهاد تحلل الاختبارات على نفس اللوحة. لوحة 180 ميكرولتر من تعليق خلية في كل بئر. استخدام الآبار A1، A12، H1، وH12 لتصحيح درجة الحرارة الخلفية: إضافة 180 ميكرولتر من المتوسطة مقايسة في هذه الآبار (أي خلايا). احتضان لوحات لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 200 x ج لمدة 5 دقائق مع عدم وجود فرامل للتأكد من أن كل الخلايا قد تعلق تماما. تأكيد بصريا أن الخلايا يتم الالتزام ثابت على سطح الثقافة، وتشكيل أحادي الطبقة، عن طريق عرض تحت المجهر. نقل لوحات العودة إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة إضافية. إعداد 10X تركيزات المركبات، وتحميل من الموانئ الحاقن لاختبار الإجهاد الميتوكوندريا، وإعداد 2.5 مل لكل منهما من 10 أوليغوميسين ميكرومتر، 1 ملم إدارة التخطيط الوطني، وخليط من 10 ميكرومتر روتينون و 10 ميكرومتر أنتيمايسين إيه، كل في الميتوكوندريا جامعة المدينة العالمية إجهاد فحصم. ملاحظة: إن تركيز 2،4-إدارة التخطيط الوطني يستند إلى الدراسات التي نشرت سابقا (21)؛ وهذا هو المبدأ التوجيهي العام ولكن تركيز uncoupler لكل نوع من الخلايا يجب أن يحددها الباحث المستخدمة. لاختبار الإجهاد تحلل، وإعداد 2.5 مل لكل 250 ملي الجلوكوز، 10 أوليغوميسين ميكرومتر، و 500 مم 2-deoxyglucose (2-DG) في المتوسط تحلل الإجهاد الفحص. الدافئة 10X الحلول إلى 37 درجة مئوية، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4. تحميل المركبات في منافذ حاقن المناسبة من خرطوشة باستخدام micropipettor متعددة وأدلة تحميل، على النحو التالي: ميناء الميتوكوندريا الفحص الإجهاد تحلل الإجهاد الفحص ا 20 ميكرولتر أوليغوميسين 20 الجلوكوز ميكرولتر ب 22 ميكرولتر 2،4-DNP 22 ميكرولتر أوليغوميسين C 25 ميكرولتر أنتيمايسين إيه / روتينون 25 ميكرولتر 2-DG الجدول 3: كميات غير مفروشة. ملاحظة: كل سلسلة من الموانئ (على سبيل المثال، جميع الموانئ أ) يجب أن يحتوي على نفس الحجم. ومن الأهمية بمكان أن جميع الآبار في سلسلة معينة يتم تحميل، حتى تلك التي لا تستخدم في التجربة، وإلا لن يتم حقن هذه المركبات (الموانئ في الآبار غير المستخدمة يمكن تحميلها مع نفس الحجم من متوسطة فحص). احتضان خرطوشة أثناء إعداد البرنامج. إعداد خارج الخلية الجريان الفحص البروتوكولات إعداد البرنامج التالي (جدول 4). خطوة حلقة غيرمنتهية </tص> معايرة – موازنة – قراءات أساسية 3 مرات: اخلطي 3 دقائق، وانتظر 0 دقيقة، وقياس 3 دقيقة حلقة نهاية – حقن المنفذ A – قياسات 3 مرات: اخلطي 3 دقائق، وانتظر 0 دقيقة، وقياس 3 دقيقة حلقة نهاية – حقن ميناء B – قياسات 3 مرات: اخلطي 3 دقائق، وانتظر 0 دقيقة، وقياس 3 دقيقة حلقة نهاية – حقن ميناء C – قياسات 3 مرات: اخلطي 3 دقائق، وانتظر 0 دقيقة، قياس آثافةه 3 دقيقة حلقة نهاية – برنامج نهاية – الجدول 4: تخطيط البرنامج. ملاحظة: في ظروف معينة، على سبيل المثال، عند استخدام خلايا تفعيلها، قد يستمر تحمض لفترة أطول مما كان عليه في خلايا ساذجة. لهذا السبب، قد يكون من الضروري تمديد "الانتظار" مرة في البرنامج المذكور أعلاه أو تكرار كل دورة قياس أكثر من مرة. بدء البرنامج. بعد الخطوة المعايرة، استبدال لوحة calibrant لوحة فحص (عند المطالبة). ملاحظة: استخدام البرنامج، فمن الممكن للإشارة إلى مجموعة من الآبار التي لديها ظروف مماثلة. بالإضافة إلى ذلك، لا بد من الإشارة إلى الآبار هي آبار المراقبة (في هذا البروتوكول، وأنها هي الأركان الأربعة للوحة)، والتي تشير إلى آبار فارغة. لأكثر تفصيلا، خطوة بخطوة، بروتوكول لكيفية إعداد الجهاز والصورة البرمجيات، ينبغي استشارة موقع الشركة المصنعة. قياس محتوى البروتين إزالة المتوسطة فحص المتبقية من كل بئر من دون إزعاج الخلايا. ملاحظة: إذا كان ليست مريحة على المضي قدما في فحص تركيز البروتين، فمن الممكن تجميد لوحة كاملة في -20 درجة مئوية حتى التحليل. إذا جمدت، ذوبان الجليد قبل المتابعة. إعداد 1X حل من مثبطات الأنزيم البروتيني (100X الأوراق المالية) في المعهد الملكي تحلل المتوسطة (ما يكفي لمدة 50 ميكرولتر / جيد). إضافة 50 ميكرولتر المعهد الملكي تحلل المتوسطة تستكمل مع مثبطات الأنزيم البروتيني إلى كل بئر. تستنهض الهمم لوحة على شاكر لمدة 5 دقائق، ثم احتضان لوحة على الجليد لمدة 30 دقيقة إلى الخلايا ليز بالكامل. تدور لوحة في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لجلب الدهون والجزيئات الأخرى على الجزء السفلي من لوحة بحيث لا تتداخل مع فحص الحمض bicinchoninic (BCA). قياس تركيز البروتين عن طريق فحص BCA فقا للشركة المصنعة و# 39؛ ق التوصيات.
Representative Results
الخلايا حقيقية النواة استخدام شبكة متكاملة من تحلل، وحمض الكربوكسيليك دورة (TCA)، والفسفرة التأكسدية لتلبية معظم الطلب على الطاقة وتوفير السلع الوسيطة اللازمة لنمو الخلايا وانتشارها. هذه المسارات تبدأ محاصرة الخلايا الجلوكوز مجانا في شكل الجلوكوز 6 فوسفات، والذي بعد ذلك يحصل على معالجتها في البيروفات. البيروفات إما خفضت إلى اللاكتات أو نقلها إلى الميتوكوندريا، حيث أنها تشكل أسيتيل التميم A (لجنة الزراعة). ثم يدخل أسيتيل التميم في دورة TCA. وسيطة ذات الطاقة العالية لدورة TCA دفع حركة الإلكترونات في سلسلة نقل الإلكترون (ETC)، والتي بدورها يطرد H + من المصفوفة الميتوكوندريا لتوليد H + التدرج عبر الغشاء الميتوكوندريا الداخلية. يعمل الأكسجين كما متقبل الإلكترون النهائي، وH + العودة إلى مصفوفة الميتوكوندريا من خلال F O / F <فرعية> 1 تعقيدا، حيث يتم استخدام الطاقة المحتملة لتوليد ATP (الشكل 1A). مبدأ عمل فحص تدفق خارج الخلية يعتمد على التدخل في تحلل والفسفرة التأكسدية في نقاط محددة، وتقييم الآثار الناتجة عن ذلك. لهذا الغرض، وكنا الجلوكوز إلى نشر تحلل في الخلايا جوعا، و2-deoxyglucose (2-DG)، والتي يتم تحويلها إلى 2 deoxyglucose-6-فوسفات، مثبط تنافسي من phosphoglucoisomerase 23، قبل هيكسوكيناز، من أجل منع تحلل. روتنون (أ أنا محددة المانع المعقد للETC)، أنتيمايسين إيه (مجمع المانع الثالث محددة من ETC)، أوليغوميسين (المانع من سينسيز اعبي التنس المحترفين 24)، وكيل فك ربط 2،4-dinotrophenol (إدارة التخطيط الوطني) 25 منهم تستخدم للتدخل أحداث محددة تتعلق الإلكترون النقل وتدرج البروتونات والتوليف اعبي التنس المحترفين (الشكل 1A). بدلا من 2،4-إدارة التخطيط الوطني، CYA الكربونيلويمكن أيضا nide-4- (trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون (FCCP) يمكن أن تستخدم، ولكن قد تكون هناك حاجة مزيد من التحسين. في كلتا الحالتين، ينبغي أن يكون دائما معاير uncouplers لنوع خلية معينة قبل استخدامها لتحديد تركيز الأمثل اللازم. اختبار التحمل تحلل (الشكل 1B) يبدأ مع قياس خط الأساس لمعدل تحمض خارج الخلية (ECAR) في الخلايا جوعا سابقا. وبما أن هذه الخلايا هي في حدودها الدنيا القاعدية، وبالتالي يمكن اعتبارها من الناحية العملية على أنها غير حال السكر، ويشار إلى ECAR تقاس في هذه المرحلة باسم تحمض غير حال السكر. هذا تحمض المرجح يتوافق مع CO التنفسي 2 لدت في دورة TCA تحويلها إلى HCO 3 – و H +. ويعقب ذلك حقن الجلوكوز لتنشيط تحلل، الذي يقدم على أنه زيادة في حموضة خارج الخلية ويرجع ذلك إلى تشكيل لاكتات.وتمثل هذه الزيادة في المعدل الطبيعي للتحلل. ثم الطعن في الخلايا التي تحتوي على حقن أوليغوميسين، التي تمنع توليد ATP من خلال الفسفرة التأكسدية. خلايا تستجيب لهذا الانخفاض الكبير في إنتاج ATP من خلال تفعيل تحلل إلى أقصى مستوى لها، والتي تؤدي إلى زيادة ثانوية في مستوى ECAR (احتياطي حال السكر). تم إنهاء اختبار عن طريق تثبيط الكلي للتحلل باستخدام التناظرية الجلوكوز 2-DG، والتي ترجع ECAR إلى مستواه غير حال السكر. ومن المثير للاهتمام، وقد اقترح أنه، خلافا لتوصيات الشركة الصانعة، ولم يبلغوا تحلل القصوى بالضرورة حقن أوليغوميسين 26. في خلايا ذات قدرة عالية حال السكر، إذا لم يكن هناك زيادة كبيرة في الطلب اعبي التنس المحترفين، قد يكون تحلل قادرة تماما على التعامل مع فقدان ATP الميتوكوندريا دون أن تحتاج إلى أن يصل التنظيم. يمكن تجاوز معدل حال السكر مع أوليغوميسين بإضافة مثبطات الجهاز التنفسيمثل روتينون وmyxothiazol، والتي توفر بعض الفوائد على أوليغوميسين: 1) أنها تزيد من الطلب اعبي التنس المحترفين، كما أنها تتسبب في انعكاس للاعبي التنس المحترفين سينسيز، مع ATP المائي، إلى ضخ البروتونات في محاولة لاستعادة غشاء الميتوكوندريا المحتملة 26؛ 2) أنها تمنع تحمض الجهاز التنفسي في المتوسط، والتي يمكن أن يتغلب على النتائج ECAR (أنظر أدناه). وتشمل وسائل أخرى لزيادة الطلب ATP إضافة مركبات التي تحفز التحليل المائي للاعبي التنس المحترفين من قبل ATPases غشاء البلازما 26. كل هذا يجب أن تدرس بعناية من قبل الباحثين عند التخطيط لاختبار التحمل تحلل. اختبار التحمل الميتوكوندريا (الشكل 1C) يبدأ مع قياس خط الأساس لمعدل استهلاك الأكسجين (OCR) في الخلايا غير المتعطشة. ويعقب ذلك حقن أوليغوميسين، الذي يحول دون عودة البروتونات من خلال مجمع F O / F 1، وبالتالي hyperpolariz بسرعة وفاق غشاء الميتوكوندريا. فرط يمنع المزيد من بروتون ضخ من خلال المجمعات الجهاز التنفسي، وانخفاض معدل التنفس. ويطلق على التنفس المتبقية تسرب بروتون، الذي يمثل تدفق البروتونات من خلال الدهون أو غيرها من القنوات. يتم عكس هذه الدولة hyperpolarized بسرعة عن طريق إضافة وكيل فك ربط 2،4-إدارة التخطيط الوطني، الذي يعمل بمثابة حامل الأيون البروتون. وردا على ذلك خلايا في محاولة لاستعادة غشاء المحتملة في محاولة غير مجدية من خلال زيادة معدل نقل الإلكترون إلى الحد الأقصى، وهذا بدوره يزيد من التعرف الضوئي على الحروف. وأخيرا، مع إضافة اثنين من مثبطات ETC (أنتيمايسين إيه وروتينون)، التنفس الميتوكوندريا يتوقف تماما والتعرف الضوئي على الحروف تنخفض إلى أدنى مستوى لها. على هذا المستوى، واستهلاك الأوكسجين لا يعود الى النشاط الميتوكوندريا (غير الميتوكوندريا). ويسمى الفرق في التعرف الضوئي على الحروف التي تولدها هذه المثبطات أقصى التنفس الميتوكوندريا، وهو مبلغ من التنفس الأساسية والطاقة الفائضة. <p الطبقة = "jove_content" fo: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> B والعزلة الخلايا التائية تسفر قابلة للحياة غاية السكان اللمفاويات النقي. تم عزل الخلايا البائية والخلايا CD4 + T ساذجة على النحو المبين في المادة 4 من البروتوكول، والتي تم الحصول عليها splenocytes ببساطة عن طريق الناشر خلايا الدم الحمراء كما هو موضح في القسم 3.3. حساسية من نوع معين الخلية المقايسات التمثيل الغذائي يعتمد على سلامة ونقاء من السكان خلية البداية. ولذلك، من أجل التحقق من صلاحية الخلايا المعزولة الماوس T، splenocytes والخلايا البائية، ونقاء من الخلايا T و B، وكانت ملطخة قسامات صغيرة من الخلايا لتحليل تدفق cytometric (الشكل 2). في الأمام مبعثر المنطقة مقابل الجانب مبعثر في منطقة (FSC-A مقابل SSC-A) مؤامرة، وبوابات الخلايا الليمفاوية، وخلال هذه البوابة، السكان على طول قطري في الأمام مبعثر هيغتم تحديد ر (FSC-H) مقابل FSC-A مؤامرة كما singlets ل. بين السكان القميص، وقد تم قياس الجدوى التي تبوب الخلايا التي تلطخ سلبية لحية / علامة الميتة (الشكل 2A). وكانت الخلايا التائية الجدوى 97.9٪، وكانت الجدوى خلية طحالية 92٪، وكان بقاء الخلية ب 94٪. ب خلية النقاء، مقاسا B220 + CD19 + السكان 26، كان 99٪، في حين CD4 + T الخلية نقاء، كما تقاس CD44 – CD4 + عدد السكان 27، كان 98.3٪ (الشكل 2B). تركيز البروتين من الخلايا المحللة يمكن أن تستخدم كمؤشر مباشر من عدد الخلايا مطلي. كانت مطلية الخلايا الليمفاوية المعزولة وsplenocytes في لوحة 96-جيدا فحص المغلفة لاصقة في 5 × 5 10 خلايا / جيد، 2.5 × 5 10 خلايا / جيد، 1.25 × 10 5 خلايا / جيد، و0.625 × 10 <sup> 5 خلايا / جيد. وقد تصور التقاء في كل كثافة الطلاء من أنواع الخلايا الثلاثة تحت المجهر الخفيف (الشكل 3A). كما هو متوقع، التقاء ترتبط مع كثافة الطلاء الأولي. عند الانتهاء من فحص تدفق خارج الخلية، وهي lysed خلايا مطلي وكان كميا تركيزات البروتين باستخدام مقايسة BCA. لجميع أنواع الخلايا، وأظهرت تركيزات البروتين المحللة إلى أن تكون مرتبطة خطيا مع كثافة الطلاء الأولي (الشكل 3B)، مما يؤكد أن تركيزات البروتين المحللة يمكن استخدام مقياس دقيق لتطبيع أعداد الخلايا عند تفسير البيانات تدفق خارج الخلية. وقد تم تحسين كثافة الطلاء المستخدمة في هذه التجربة لساذجة، الخلايا الليمفاوية unstimulated. إذا كانت الخلايا حفز أو مستنبت سابقا هي لاستخدامها، قد تكون هناك حاجة مزيد من التحسين. الميتوكندريا وstres حال السكرالصورة المقايسات تعتمد على عدد الخلايا مطلي. تم قياس التعرف الضوئي على الحروف لكل نوع من الخلايا وكثافة الطلاء في محلل تدفق خارج الخلية. كما هو متوقع، أعداد الخلايا أعلى لها OCR أعلى قياسه، وكذلك ردود أكثر دراماتيكية لأوليغوميسين، 2،4-إدارة التخطيط الوطني، وأنتيمايسين إيه / روتينون (الشكل 4A). توحيد قياسات التعرف الضوئي على الحروف لتركيز البروتين لكل عينة يكشف أنه في عام، أعداد أكبر من الخلايا تؤدي قياسات OCR لأكثر دقة. الطلاء في 5 و 2.5 × 5 10 خلايا / أدى بشكل جيد في قياسات OCR تطبيع مماثلة في خلايا T وsplenocytes، و 5، و 1.25 × 10 5 خلايا / جيد أدى القياسات OCR تطبيع مماثلة في خلايا B (الشكل 4B). الاختلافات الطفيفة في الخلية B تطبيع قد يكون القياسات التعرف الضوئي على الحروف مؤشرا غير مباشر على الخلايا البائية أداء أفضل عند 2.5 × 10 5 خلايا / جيد بالمقارنة مع كثافة الخلايا الأخرى. بكل المقاييس، وقدم 0.625 × 10 5 خلايا / جيد النتائج المثلى، مما يدل على أن هذه الكثافة الطلاء غير كافية. التنفس خط الأساس، تسرب بروتون، والحد الأقصى التنفس الميتوكوندريا، والتنفس غير الميتوكوندريا، وإنتاج ATP المترابطة خطيا مع كثافة الطلاء لجميع أنواع الخلايا (الشكل 4C). بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام أكثر من التنفس الأساسي نحو توليف اعبي التنس المحترفين، كما يدل على ذلك انخفاض تسرب بروتون في أنواع الخلايا الثلاث. في حين أن التركيز الأساسي للتجربة الإجهاد الميتوكوندريا هو قياس التغيرات في التعرف الضوئي على الحروف، وECAR لا تزال مفيدة لتسجيل للتأكد من أن الفحص كان نفذت بنجاح. على غرار التعرف الضوئي على الحروف، ادى الى دولتين كثافة الطلاء العالي في أعلى ECAR وردود أكثر دراماتيكية لأوليغوميسين، 2،4-إدارة التخطيط الوطني، وأنتيمايسين إيه / روتينون (الشكل 4D). التغيرات الهائلة في ECAR على إضافة 2،4-إدارة التخطيط الوطني، وأنتيمايسين إيه / روتينون قد يكون نتيجة للتغيرات في التنفس بالإضافة إلى التغييرات في زlycolysis، منذ CO 2 ولدت في دورة TCA يتم تحويلها إلى HCO 3 – و H +. وقد تناولت هذه المسألة مؤخرا، وهناك توجد طريقة بسيطة لتصحيح مجموع إشارة تحمض خارج الخلية باستخدام بيانات استهلاك الأوكسجين، للحصول على معدل حال السكر الحقيقي 12،29. وكان فحص الإجهاد تحلل الأكثر نجاحا على أعلى كثافة الطلاء (الشكل 5A، B). في جميع أنواع الخلايا، كانت 5 عينات × 10 5 خلية / على أهم التغييرات في ECAR بعد إضافة السكر، أوليغوميسين، و2-DG (الشكل 5B). بالإضافة إلى ذلك، وتطبيع للتركيز البروتين أثبت أن لجميع أنواع الخلايا، و5 × 5 10 خلايا / جيد عينات حققت نتائج أفضل، بينما خصوصا تركيزات 0.625 × 10 5 خلية / جيدا لم يتم عرض أقل قدرة قوية احتياطي حال السكر. غير glycolytiج تحمض، تحلل، والقدرة حال السكر واضحة مرتبطة خطيا مع كثافة الطلاء لجميع أنواع الخلايا (الشكل 5C). للتجربة الإجهاد تحلل، ويظهر الرسم البياني OCR أن الجلوكوز يحفز قليلا التنفس الميتوكوندريا، وهو بعد ذلك تحول دون العلاج أوليغوميسين. لم إضافة 2-DG لن يؤثر على التعرف الضوئي على الحروف (الشكل 5D). الرسم البياني OCR يمكن استخدامه كمؤشر آخر على أن أجريت التجربة الإجهاد تحلل بنجاح. أيضا، والرسم البياني OCR يمكن استخدامها لتصحيح الرسم البياني ECAR، إذا لزم الأمر، كما هو موضح أعلاه في حالة اختبار التحمل الميتوكوندريا 12،29. الشكل 1: مخطط المقايسات تدفق خارج الخلية (A) رسم توضيحي لتحلل (يسار) والفسفرة المؤكسدة (يمين) والتي تبين عملالأدوية الأيضية المستخدمة في المقايسات تدفق خارج الخلية. (ب) تخطيطي لخارج الخلية معدل حموضة (ECAR) الرسم البياني. التخطيطي لمعدل استهلاك الأكسجين (OCR) الرسم البياني (C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. . الشكل 2: النابضة السائر خلايا تي، الخلايا البائية، وsplenocytes لتحديد سلامة ونقاء التدفق الخلوي المؤامرات تبين جدوى خلايا T، splenocytes والخلايا البائية (A)؛ ونقاء T والخلايا B (B). النتائج تمثيلية لا تقل عن ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من الهو الرقم. الشكل (3): التقاء خلية يرتبط مع تركيزات البروتين المحللة من كل نوع من الخلايا في كثافة الطلاء المختلفة (A) الميكروسكوب ضوء من الخلايا في الآبار لوحة فحص في كثافة الطلاء تتراوح بين 5 × 5 10 خلايا / جيد إلى 0.625 × 10 5 خلية / حسنا. أشرطة النطاق دلالة 50 ميكرون. تركيزات بروتين (ب) المحللة في كثافة الطلاء المختلفة، مقاسا مقايسة BCA. النتائج تمثيلية لا تقل عن ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل (4): وتظهر الميتوكوندريا فحص الإجهاد. أولية (أ) وموحدة (ب) التعرف الضوئي على الحروف لكل نوع من الخلايا وكثافة الطلاء. (ج) التغيرات خلية تعتمد على عدد من مستويات خط الأساس، والحد الأقصى الميتوكوندريا والتنفس غير الميتوكوندريا، فضلا عن استهلاك الأكسجين مرتبطة تسرب بروتون أو إنتاج ATP، وترد لكل أنواع الخلايا. وتظهر القيم (د) الخام ECAR تم الحصول عليها من اختبارات التحمل الميتوكوندريا. وتمثل كل نقطة بيانات متوسط 7-8 الآبار مع الانحراف المعياري. السهام المسمى دلالة حقن أوليغوميسين (O)، 2،4-إدارة التخطيط الوطني (D)، وروتينون / أنتيمايسين إيه (R / A). النتائج تمثيلية لا تقل عن ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. _upload / 54918 / 54918fig5.jpg "/> وتظهر حال السكر إجهاد فحص الخام (A) وموحدة (ب) ECAR لكل نوع من الخلايا وكثافة الطلاء: الرقم 5. (C) وتظهر التغيرات التي تعتمد على عدد الخلايا في ECAR لتحمض غير حال السكر، تحلل الناجم عن الجلوكوز وإجمالي الطاقة حال السكر. وتظهر القيم (د) الخام OCR تم الحصول عليها من اختبارات التحمل حال السكر. وتمثل كل نقطة بيانات متوسط 7-8 الآبار مع الانحراف المعياري. السهام المسمى دلالة حقن الجلوكوز (G)، أوليغوميسين (O)، و2-deoxyglucose (2-DG). النتائج تمثيلية لا تقل عن ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
بروتوكول قمنا بتطوير يسمح للعزلة فعالة لمجموعات فرعية نقية وقابلة للحياة الخلايا اللمفاوية، والتي كانت تستخدم في وقت لاحق في تحليل تدفق خارج الخلية بتركيزات مختلفة لتقييم الاختلافات في تحلل وأداء التنفس الميتوكوندريا. تم تصميم هذا البروتوكول على وجه التحديد لالخلايا الليمفاوية ويعالج اعتبارات خاصة تتعلق هذين النوعين من الخلايا، مثل انخفاض النشاط الأيضي القاعدية، وهشاشة، التردد المنخفض، وعدم قدرتهم على الالتزام وحات الفحص. وبالتالي، مقارنة البروتوكولات التي تم نشرها مسبقا 11،12، لدينا وسيلة يقدم دليلا أكثر ملاءمة والأمثل أفضل للباحثين العاملين في مجال علم المناعة. هناك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول، بما في ذلك الحصول على السكان الخلية نقية وقابلة للحياة، طلاء الخلايا في التقاء الأمثل، وتوحيد القياسات فحص التدفق خارج الخلية إلى تركيز البروتين في كل بئر.
طيكون كميا عدد nitial الخلايا يمكن تصوره على حد سواء بواسطة المجهر الضوئي وأيضا مطلي باستخدام قياسات تركيز البروتين. أكد علاقة خطية بين عدد الخلايا وتركيز البروتين أن تركيز البروتين يمكن في الواقع أن تستخدم كوسيلة لتوحيد آثار التغيرات في أعداد الخلايا بين آبار مختلفة.
من خلال توحيد ECAR والتعرف الضوئي على الحروف النتائج إلى تركيزات البروتين، وأظهرت أنه على الرغم من انخفاض التقاء الخلايا، وعدد قليل من 2.5 × 5 10 خلايا / جيد يمكن أن تستخدم في معظم فحوصات دون المساس بنوعية البيانات. ومع ذلك، فإن الحد الأدنى من الخلايا التي يمكن استخدامها تختلف بين أنواع الخلايا وفحوصات. على سبيل المثال، في حين أن عدد قليل من 1.25 × 10 5 خلايا يمكن أن تستخدم لقياس OCR الخلايا البائية، حتى 2.5 × 5 10 خلايا / كانت كذلك ليست كافية لتقييم أداء حال السكر من نفس نوع من الخلايا. لذلك، ما دام عدد الخلايا ليست عاملا مقيدا، والطلاء في أكثر من90٪ التقاء، وهو ما يعادل تقريبا 5 × 10 5 الخلايا الليمفاوية / جيد، هو الأفضل. قد تكون هناك حاجة مزيد من التحسين عندما خلايا مختلفة الأحجام مثل تفعيلها سابقا، والخلايا الليمفاوية تستخدم متباينة جزئيا. بالإضافة إلى ذلك، عند استخدام الخلايا الليمفاوية الأولية مثقف سابقا، قد يكون هناك اختلاف في بقاء الخلية بين الشروط معاملة مختلفة، التي من شأنها أن تقلل من الاعتماد على تركيز البروتين كمقياس لعدد الخلايا منذ القتلى أو يمكن أن الخلايا الميتة أن يسهم أيضا في مستويات البروتين المقاسة . في مثل هذه الحالات، قد يكون من المفيد لفرز الخلايا الحية عن طريق التدفق الخلوي قبل تنفيذ المقايسات تدفق خارج الخلية.
لدينا في المقايسات باستخدام السكان لمفاوية معزولة طازجة وقابلة للحياة للغاية، ونحن الحصول على بيانات وظيفية يمكن الاعتماد عليها لكلا القياسات التعرف الضوئي على الحروف وECAR. في حين أن جميع أنواع الخلايا تصرفت على نحو مماثل في اختبار التحمل الميتوكوندريا، كانت فوارق بين أنواع الخلايالوحظ في اختبار التحمل تحلل. على سبيل المثال، كان أداء حال السكر للخلايا T ساذجة منخفضا مقارنة splenocytes أو الخلايا البائية، وأنها لم تتغير مع إضافة أوليغوميسين. هذه الملاحظة بما يتفق مع الدراسات التي نشرت سابقا 7،30، يؤكد صحة بروتوكول لدينا.
في الختام، لدينا وسيلة يقدم وسيلة فعالة ومريحة لاختبار النشاط الأيضي من الخلايا الليمفاوية باستخدام محلل تدفق خارج الخلية، ويمكن أن يكون مفيدا في مجموعة واسعة من الدراسات المناعية استكشاف التغيرات الأيضية في الخلايا المناعية على التنشيط، تمايز الخلايا أو بسبب إلى الظواهر المرض مثل العدوى، وأمراض المناعة الذاتية والدموية والأورام الخبيثة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) for support and discussion, Ms. Ann Kim for optimizing the B cell isolation protocol, Dr. Joseph Brzostowski for his help with microscopy, and Ms. Mirna Peña for maintaining the animals used. This study was supported by the Intramural Research Programs of the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, and National Heart, Lung, and Blood Institute.
Materials
| PBS (pH 7.2) | Gibco-ThermoFisher | 20012-050 | To make MACS buffer |
| Bovine Serum Albumin BSA | Sigma-Aldrich | A3803 | To make MACS buffer |
| 0.5M EDTA, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | To make MACS buffer |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator. |
| RPMI-1640 | Gibco-ThermoFisher | 11875-093 | Contains phenol red and L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum | Gibco-ThermoFisher | 10437-028 | For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 °C water bath and then inactivate at 56 °C for 30 minutes. Aliquot heat-inactivated serum for storage (e.g., in 50 mL conical tubes) and freeze at -20 °C until needed. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Gibco-ThermoFisher | 15140-122 | Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500mL media, make a total of 12 mL Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 °C until ready to make media. |
| L-Glutamine 200mM (L-Glut) | Gibco-ThermoFisher | 25030-081 | Component of RF10 and stress test media |
| Sodium pyruvate 100mM | Gibco-ThermoFisher | 11360-070 | Component of RF10 and stress test media |
| HEPES 1M | Gibco-ThermoFisher | 15630-080 | Component of RF10 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco-ThermoFisher | 11140-050 | Component of RF10 |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco-ThermoFisher | 21985-023 | Component of RF10 |
| Falcon 70 μm cell strainer | Falcon-Fischer Scientific | 87712 | Used in cell isolation |
| Monoject 3 mL Syringe, Luer-Lock Tip | Covidien | 8881513934 | Used in cell isolation |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Used in cell isolation |
| CellTrics 30 μm cell filter, sterile, single-packed | Partec CellTrics | 04-004-2326 | Used in cell isolation |
| B Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | Used in cell isolation |
| Naïve CD4+ T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-104-453 | Used in cell isolation |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in cell isolation |
| MidiMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnet for separation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | Holder for magnets |
| autoMACS Rinsing Solution | 130-091-222 | Rinsing solution for autoMACS Pro Separator | |
| autoMACS Pro Separator Instrument | Miltenyi Biotec | N/A | |
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375-5G | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg). |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| 2,4 Dinotrophenol (2,4-DNP) | Sigma-Aldrich | D198501 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Supplied as 100X cocktail, combine with RIPA to form 1X solution for lysis. |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | Follow manufacturer's instructions |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Seahorse Bioscience | 101085-004 | Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution. |
| Seahorse XF Base Medium | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Used to prepare stress test media |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | ||
| Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 μm | EMD Millipore-Fisher Scientific | SCGPU10RE | Used to sterile filter media. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 487031 | Dissolved to 0.1M and used to dilute Cell-Tak. |
References
- Motz, G. T., Coukos, G. Deciphering and reversing tumor immune suppression. Immunity. 39 (1), 61-73 (2013).
- Akkaya, M., Barclay, A. N. How do pathogens drive the evolution of paired receptors?. Eur J Immunol. 43 (2), 303-313 (2013).
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu Rev Immunol. 27, 591-619 (2009).
- Dinarello, C. A. Proinflammatory cytokines. Chest. 118 (2), 503-508 (2000).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat Rev Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342 (6155), 1242454 (2013).
- Gerriets, V. A., Rathmell, J. C. Metabolic pathways in T cell fate and function. Trends Immunol. 33 (4), 168-173 (2012).
- Doughty, C. A., et al. Antigen receptor-mediated changes in glucose metabolism in B lymphocytes: role of phosphatidylinositol 3-kinase signaling in the glycolytic control of growth. Blood. 107 (11), 4458-4465 (2006).
- Caro-Maldonado, A., et al. Metabolic reprogramming is required for antibody production that is suppressed in anergic but exaggerated in chronically BAFF-exposed B cells. J Immunol. 192 (8), 3626-3636 (2014).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods Enzymol. 542, 125-149 (2014).
- Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J Vis Exp. (106), e53464 (2015).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
- Klein, A. B., et al. Impact of different cell isolation techniques on lymphocyte viability and function. J Immunoassay Immunochem. 27 (1), 61-76 (2006).
- Hsueh, R. C., et al. Purification and Characterization of Mouse Splenic B Lymphocytes. AfCS Research Reports. 1 (1), 1-11 (2012).
- Zambrano, K., et al. Prolonged ex vivo expansion and differentiation of naive murine CD43 B splenocytes. Biotechnol Prog. , (2016).
- Costa, G. L., et al. Targeting rare populations of murine antigen-specific T lymphocytes by retroviral transduction for potential application in gene therapy for autoimmune disease. J Immunol. 164 (7), 3581-3590 (2000).
- Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
- Schneider, D. F., Glenn, C. H., Faunce, D. E. Innate lymphocyte subsets and their immunoregulatory roles in burn injury and sepsis. J Burn Care Res. 28 (3), 365-379 (2007).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 9 (2001).
- Akkaya, B., et al. A Simple, Versatile Antibody-Based Barcoding Method for Flow Cytometry. J Immunol. 197 (5), 2027-2038 (2016).
- Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. J. Clin. Invest. 125 (12), 4592-4600 (2015).
- Wick, A. N., et al. Localization of the Primary Metabolic Block Produced by 2-Deoxyglucose. J. Biol. Chem. 224 (2), 963-969 (1957).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase system. Methods Enzymol. 55, 472-518 (1979).
- Terada, H. Uncouplers of oxidative phosphorylation. Environmental Health Perspectives. 87, 213-218 (1990).
- Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PLOS ONE. 11 (3), e0152016 (2016).
- Lai, L., Alaverdi, N., Maltais, L., Morse, H. C. Mouse cell surface antigens: nomenclature and immunophenotyping. J Immunol. 160 (8), 3861-3868 (1998).
- Gerberick, G. F., Cruse, L. W., Miller, C. M., Sikorski, E. E., Ridder, G. M. Selective modulation of T cell memory markers CD62L and CD44 on murine draining lymph node cells following allergen and irritant treatment. Toxicol Appl Pharmacol. 146 (1), 1-10 (1997).
- Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim. Biophys. Acta – Bioenergetics. 1847 (2), 171-181 (2015).
- Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. J Exp Med. 212 (9), 1345-1360 (2015).
Cite This Article
Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. J. Vis. Exp. (117), e54918, doi:10.3791/54918 (2016).