リンパ球における解糖およびミトコンドリア呼吸を分析するために最適化されたプロトコル

全ての動物実験は、NIAID動物管理使用委員会によって承認されたLIG-4動物プロトコールに従って行いました。 試薬の調製磁気分離（MS）は、バッファを準備し、0.5％BSAおよび2mMのEDTA又は0.5％BSAを補充した自動分離液を補充したPBS（pHは7.2）。滅菌フィルター（0.22μm）で、2〜8℃で保存。 RF10培地を準備し、10％の熱不活性化ウシ胎児血清、50 U / mlペニシリン、50μMストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン、0.1mMの非必須アミノ酸、50μM2を補充したRPMI 1640培地メルカプトエタノール、10mMのHEPES。無菌の試薬を使用してください。 2〜8℃で滅菌フィルターとストア。 1mMピルビン酸ナトリウム、2mMのL-グルタミン及び25mMのグルコースを補充したXF基本培地：ミトコンドリアストレステスト媒体を準備します。 XFベースの媒体supplemen：解糖負荷試験媒体を準備します2 mMのL-グルタミンとテッド。 2〜8℃で7.4、滅菌フィルターとストアにミトコンドリアと解糖ストレステスト媒体の両方のpHを調整します。 37℃、使用前に再調整のpH（37℃でのpH測定を行う）の温かい媒体。 注：XF媒体を使用して、重炭酸塩を欠いているが重要です。細胞外フラックスアナライザー内の雰囲気だけ周囲のCO 2が含まれているので、培地中の任意の重炭酸塩は、解糖の副産物として放出されたプロトンに結合すると、CO 2と水を形成するために解離します。 CO 2は、実験中の脱ガスは、解糖の酸性化信号を不明瞭になり、pHのドリフトを引き起こすでしょう。 オリゴマイシン準備：DMSO中の10mMストック溶液を調製します。 -20℃で保存します。 2,4-DNPの準備：DMSO中の1Mストック溶液を準備します。 -20℃で保存します。 アンチマイシンAを準備：DMSO中の10mMストック溶液を調製します。 -20℃で保存します。 ロテノンを準備：10mMの秒を準備DMSO中のタック溶液; -20℃で保存します。 グルコースを準備：250mMの溶液を形成する糖ストレス試験培地中のグルコースを溶解します。各実験の前に新鮮な準備をし、凍結しないでください。 2-DGを準備：500 mM溶液を形成するために、解糖ストレステスト媒体中に固体2-DGを溶かします。各実験の前に新鮮な準備をし、凍結しないでください。 2.マウスから収穫脾臓およびリンパ節頸椎脱臼に続いてCO 2窒息によりマウスを安楽死させます。 70％エタノールでマウスをスプレーします。 その後のT細胞の単離のために、脾臓、浅子宮頸部、表面的な/深い腋窩、下顎、鼠径、および腸間膜リンパ節を収穫。 後続のB細胞の単離のために、収穫のみ脾臓。 注：バイオセーフティキャビネットを使用して処理するまで氷上でPBSまたはRF10メディアで収穫された臓器を保ちます。すべての処理とISOL用滅菌実験器具や滅菌技術を使用してくださいエーションの手順を実行します。分離効率を高め、細胞死を減らすために氷の上ですべてのバッファとメディアを保管してください。 3.組織処理 50ミリリットルコニカルチューブの上に70μmのセルストレーナーを配置し、ストレーナに臓器を転送します。 T細胞の単離のために、全ての器官を結合のみ脾臓B細胞の単離の転送のため。 無菌の3ミリリットルシリンジからプランジャーを使用して、ストレーナを介して組織をすりつぶします。マッシングの間に、フィルタや臓器が常に湿っていると、MSのバッファを追加することにより、必要に応じてそれらを濡らしていることを確認してください。これは、両方の高い細胞生存率を維持し、フィルターの目詰まりを防ぐことができます。 マッシングの後、5月10日を適用ミリリットルMSは、細胞の回復を高めるために、フィルタにバッファ。 4℃で5分間、400×gで懸濁液を遠心。 （指定がない限り、これらの条件の下で、すべてのさらなる遠心分離を行って）。 液体をデカントし、5mlのACK赤血球溶解緩衝液を、ペレットを再懸濁します。 Incu氷上で5分間譲りは（それらは磁気分離を妨害するので、赤血球を除去する必要がある）赤血球を溶解します。 10〜20ミリリットルMSバッファと遠心を追加します。 1ミリリットルMSバッファ（赤血球溶解から破片を除去します。この濾過）でそれを15ミリリットルコニカルチューブの上に30μmのセルのフィルターを置き、プライム。遠心分離管から液体をデカントし、5ミリリットルMSバッファにペレットを再懸濁し、フィルターを通してそれを渡します。細胞の回復を増加させ、フィルターを洗浄するためにこれを使用するために4ミリリットルMS緩衝液で最初のチューブを洗浄します。 血球計又は自動化細胞カウンターを使用して、細胞の総数を決定します。この細胞数は、脾臓細胞は、その後、細胞外フラックスアッセイで使用される場合、セクション4で必要な磁気分離試薬の量を決定するために使用され、この時点で適切な数の細胞を取っておきます。 サスペンションを遠心し、磁気分離に進みます。再懸濁脾細胞が使用されていません5ミリリットルRF10中のB細胞の単離のための細胞外フラックスアッセイまで氷上に保ちます。 B細胞およびナイーブCD4 + T細胞の4磁気分離ビオチン抗体カクテル、抗ビオチンマイクロビーズ、およびMSバッファの必要なボリュームを決定します。ガイドとして10 8個の細胞については、次のボリュームを使用して、スケールアップまたは必要に応じてダウン。 注：氷上でインキュベート以来、冷蔵庫ではなく、氷上でインキュベートしたサンプルは、抗体結合効率を低下させることができるし、より長いインキュベーション時間が必要になることがあります。 ナイーブCD4 + T細胞の分離のための試薬 10 8個の細胞のボリューム （適切にスケーリング） ビオチン – 抗体カクテル 100μlの最初のインキュベーションのためのMSバッファ 400μlの抗ビオチンマイクロビーズ 200μlの CD44マイクロビーズ 100μlの第二のインキュベーションのためのMSバッファ 200μlの 5分間4℃でビオチン抗体カクテルと細胞をインキュベートします。抗ビオチンマイクロビーズ、CD44マイクロビーズを追加し、MSはバッファ、15分間4℃でインキュベートします。 表1：T細胞の単離量と指示。 B細胞の分離のための試薬 10 8個の細胞のボリューム （適切にスケーリング） ビオチン – 抗体カクテル</TD> 100μlの最初のインキュベーションのためのMSバッファ 400μlの抗ビオチンマイクロビーズ 200μlの第二のインキュベーションのためのMSバッファ 300μlの 15分間、4℃でビオチン抗体カクテルと細胞をインキュベートします。ビオチン抗体カクテルとMSバッファの適切な量を追加し、15分間、4℃で混合物をインキュベートします。抗ビオチンマイクロビーズとMSバッファの適切な量を追加し、15分間、4℃で混合物をインキュベートします。第二のインキュベーションの後、MSバッファと遠心でチューブを埋めます。 表2：B細胞単離ボリュームと指示。 MSバッファにペレットを再懸濁：手動分離のために500μlの、自動分離3-4ミリリットル。 手動または自動分離のいずれかに進みます次のように： 手動分離： 3ミリリットルMS緩衝液で洗浄することにより、フロースルー、および素数列を収集するために、以下の滅菌15ミリリットルコニカルチューブを配置し、分離磁石にLSカラムを挿入します。フロースルーを捨てます。 下塗りしたLSカラムに細胞懸濁液を移し、それを通過することを可能にします。 3ミリリットルMSバッファーとのインキュベーションの間に使用されるチューブを洗浄し、同様に列を介してこれを通過します。溶出液は、精製された細胞が含まれています。 B細胞の単離のために、新しい15ミリリットルチューブにカラムを介して第2の時間を精製細胞を渡し、洗浄工程を繰り返します。これは純度と収量を増加します。 自動分離： 自動セパレータ上に切り替え、ランニング緩衝液のレベルをチェックし、溶液および70％のエタノールをすすぎます。廃棄物の分離を開始する前に空であることを確認してください。 Tの管径に応じて適切な冷却されたラックを選択します彼未精製試料（ 例えば 、15ミリリットル）。分離プロセスを通して生存細胞を維持するために、以前に3-4時間、2〜8℃に冷却、または冷却剤が固体になるまでされているラックを使用しています。 自動セパレータの試料ステージで冷却ラックをマウントします。 スロットA1、スロットB1で陰性画分、およびC1で陽性分画のための管用チューブにサンプルチューブを置きます。複数のサンプルを収集する場合は、次の列（A2、B2、C2、 など ）で追加のチューブを配置します。 タッチスクリーン上での分離]タブを選択し、ラックのチューブの配置を示しています。分離メニューから、「枯渇する」プログラムを選択し、洗浄の適切なタイプのプログラムサイクルを完了する（下記の注を参照）。 注：「枯渇させる」プログラムは純度の優先順位を付け、マシンの最も敏感なモードを使用して、枯渇を行います。また、三つの異なる洗浄オプションがあります。QUICすすぎK、すすぎ、および睡眠。サンプルは、同じソースからのものであり、組み合わせることになっている場合は、迅速なリンスを選択します。サンプルは別々に保持する場合には、リンスを選択します。それ以上の単離は、その日に行われません場合は、マシンが単離後にシャットダウンする場合は、スリープオプションを選択します 「ファイル名を指定して実行」を押すことにより、アイソレーションを起動し、プロンプトが表示されたら、バッファレベルを確認します。プログラムが終了した後、陰性画分は、精製された細胞を含有します。 MSバッファと遠心で15ミリリットルまでのコニカルチューブを埋めます。 5ミリリットルRF10メディアにMSバッファおよび再懸濁細胞をデカントします。細胞外フラックスアッセイするまで氷上で細胞を保管してください。 注：理想的には、細胞外フラックスアッセイは、単離直後に行われるべきです。しかし、予備実験では、アッセイの結果に有意な差は、新たに単離したもの対分離の3時間以内に使用した細胞では観察されませんでした。 <p class = "jove_title"> 5。細胞外フラックスアッセイ注：ここで説明したプロトコルは、機器の96ウェルフォーマットのためです。他のフォーマットが使用される場合、ボリュームを調整する必要があります。 センサーカートリッジの水和センサカートリッジを持ち上げ、較正溶液200μlとユーティリティプレートの各ウェルを満たし、ユーティリティ板上にセンサカートリッジを下げ、較正溶液にセンサーを沈めます。 注：較正液レベルが水没センサーを維持するのに十分に高いことを確認します。カートリッジは、各ウェルについて、O 2とH +に関連するフルオロフォアを保有します。これらは、それらが正しく動作するためには水和する必要があります。 CO 2または酸素/窒素を補充していない37℃のインキュベーターにカートリッジを置きます。指定がない限り、これらの条件の下で、すべてのさらなるインキュベーションを行います。水和物に一晩カートリッジをインキュベートします。 Prepar接着剤でコーティングされたプレートのエーション 0.1 M重炭酸ナトリウムで22.4 / mlの接着剤溶液の2.5ミリリットルを準備し、pHが8.0（重炭酸塩は、接着剤の吸着のための最適pHを提供します）。 アッセイプレートの各ウェルに溶液25μlを適用し、そして20分間室温でベンチにインキュベートします。 吸引し、接着剤や滅菌水200μlを使用して二回各ウェルを洗浄します。ウェルが細胞を播種する前に乾燥しているまで待ってください。 接着剤でコーティングされたプレートに細胞を播種 5分間、200×gで室温で遠心分離した細胞。適切なアッセイ培地5mlで再懸濁細胞（ミトコンドリアのストレスとグルコースストレスメディアの製剤については上記を参照）。アッセイ培地で所望の濃度で遠心分離し、再び細胞を再懸濁（再懸濁量は濃度によって異なります。各ウェルの細胞懸濁液の180μlのを含んでいます）。 注：適切なアッセイ培地と化合物である限りsが細胞外フラックスアナライザーが同時に同じプレート上のミトコンドリアと解糖ストレステストを実行することができ、使用されています。 各ウェルに細胞懸濁液180μLをプレート。背景温度補正のために井戸A1、A12、H1、およびH12を使用します。これらのウェル（細胞なし）でのアッセイ培地180μlを添加します。 37℃で25分間プレートをインキュベートします。 すべての細胞が完全に取り付けられていることを確認するために、ブレーキなしで5分間、200×gでプレートを遠心。視覚細胞が安定的に顕微鏡下で見ることにより、単分子膜を形成し、培養表面に付着していることを確認します。さらに30分間バックインキュベーターにプレートを転送します。 化合物の10倍の濃度の調製、及びインジェクタポートの読み込み中ミトコンドリアのストレステストのために、10μMのオリゴマイシン、1 mMのDNP、および10μMロテノンおよび10μMアンチマイシンAの混合物の2.5ミリリットルそれぞれ、ミトコンドリアストレスアッセイmediu内のすべての準備メートル。 注：2,4-DNPの濃度は、以前に公表された研究に基づいています; 21これは一般的なガイドラインですが、使用される各細胞型のための脱共役剤の濃度は、研究者によって決定されるべきです。 解糖のストレステストについては、2.5ミリリットル250 mMグルコース、10μMのオリゴマイシン、および解糖ストレスアッセイ培地中の500 mMの2-デオキシグルコース（2-DG）のそれぞれを準備します。 ウォーム10倍〜37℃のソリューション、およびpHを7.4に調整します。 次のように、マルチチャンネルピペットを用いて、カートリッジの適切なインジェクタポートとローディングガイドに化合物をロードします。 ポート ミトコンドリアストレスアッセイ 解糖ストレスアッセイ A 20μlのオリゴ 20μlのグルコース B 22μlの2,4-DNP 22μlのオリゴ C言語 25μlのアンチマイシンA /ロテノン 25μlの2-DG 表3：化合物のボリューム。 注：ポートの各シリーズ（ 例えば 、すべてのポートA）が同じボリュームを含む必要があります。それ以外の場合の化合物は、（未使用のウェル内のポートは、アッセイ媒体の同じボリュームをロードすることができます）に注入されることはありません、でも、実験に使用されていないものを、与えられたシリーズの全てのウェルがロードされていることが重要です。 プログラムの設定中にカートリッジをインキュベートします。 細胞外フラックスアッセイプロトコルの設定次のプログラム（ 表4）を設定します。 ステップ ループ </tR> 較正 – 平衡 – ベースラインの読み 3回：3分を混ぜ、0分を待って、メジャー3分エンドループ – ポートAを注入 – 測定結果 3回：3分を混ぜ、0分を待って、メジャー3分エンドループ – ポートBを注入 – 測定結果 3回：3分を混ぜ、0分を待って、メジャー3分エンドループ – ポートCを注入 – 測定結果 3回：3分を混ぜ、0分を待って、measurE 3分エンドループ – 終了プログラム – 表4：プログラムのレイアウト。 注：活性化された細胞を使用した場合、一定の条件では、 例えば 、酸性化は、ナイーブ細胞よりも長く継続することができます。このため、各測定サイクル以上の時間を上記のプログラムに「待機」時間を延長するか繰り返す必要があるかもしれません。 プログラムを開始します。較正ステップの後、アッセイプレート（プロンプトが表示）のための較正プレートを交換してください。 注：ソフトウェアを使用して、同様の条件を有するウェルのグループを指示することが可能です。加えて、ウェルは対照ウェルであるかを示すために（このプロトコルでは、彼らはプレートの四隅あり）、空である井戸を示すために重要です。マシンを設定するための、より詳細な、ステップバイステップ、プロトコルのために、それsのソフトウェア、メーカーのウェブサイトでは、相談する必要があります。 タンパク質含有量を測定します細胞を乱すことなく、各ウェルからの残りのアッセイ培地を除去します。 注：これは、タンパク質濃度アッセイを続行することができない場合、それは分析まで-20℃で全プレートを凍結することが可能です。凍結した場合は、続行する前に解凍。 （50μl/ウェルのための十分な）RIPA溶解媒体中のプロテアーゼ阻害剤（100×ストック）の1×溶液を調製します。 各ウェルに、プロテアーゼ阻害剤を補充した50μlのRIPA溶解媒体を追加します。 5分間シェーカー上でプレートを攪拌してから、完全に細胞を溶解し、30分間氷上で静置します。 彼らはビシンコニン酸（BCA）アッセイを妨害しないように、プレートの底に脂質および他の分子をもたらすために、室温で5分間、200×gでプレートをスピン。 製造業者によれば、BCAアッセイによりタンパク質濃度を測定＆＃39; sの提言。