Un protocollo ottimizzato per analizzare glicolisi e mitocondriale respirazione nei linfociti

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il protocollo animali LIG-4, che è stato approvato dal Comitato di cura e l'uso degli animali NIAID. 1. Preparazione dei reagenti Preparare tampone di separazione magnetica (MS): PBS (pH 7,2) supplementato con 0,5% BSA e 2 mM EDTA o soluzione separazione automatica supplementato con 0,5% BSA. filtro sterile (0,22 micron) e conservare a 2-8 ° C. Preparare media RF10: terreno RPMI 1640 supplementato con 10% di siero fetale bovino inattivato al calore, 50 U / ml di penicillina, 50 pM streptomicina, 1 mM di sodio piruvato, 2 mM L-glutammina, 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 50 pM 2 -mercaptoetanolo, 10 mM HEPES. Utilizzare i reagenti sterili. filtro sterile e conservare a 2-8 ° C. Preparare mitocondriale mezzo di stress test: terreno di base XF supplementato con piruvato di sodio 1 mm, 2 mm L-glutammina e 25 mm di glucosio. Preparare la glicolisi mezzo di stress test: medio supplemen di base XFTed con 2 mM L-glutammina. Regolare il pH di entrambi i mezzi di prova mitocondriale e lo stress glicolisi a 7.4, filtro sterile e conservare a 2-8 ° C. mezzi Riscaldare a 37 ° C e ri-regolare il pH prima dell'uso (la misurazione del pH a 37 ° C). NOTA: L'utilizzo medio XF, che manca il bicarbonato, è critica. Poiché l'atmosfera nell'analizzatore flusso extracellulare contiene solo CO ambiente 2, qualsiasi bicarbonato nel mezzo, in seguito al legame di protoni rilasciati come sottoprodotto della glicolisi, lo dissocia per formare CO 2 ed acqua. CO 2 sarà Degas durante l'esperimento, causando derive di pH che oscurare il segnale acidificazione glicolitico. Preparare oligomicina: Preparare 10 mM soluzione madre in DMSO; conservare a -20 ° C. Preparare 2,4-DNP: Preparare 1 M soluzione madre in DMSO; conservare a -20 ° C. Preparare antimicina A: Preparare 10 mM soluzione madre in DMSO; conservare a -20 ° C. Preparare rotenone: Preparare 10 mM ssoluzione tock in DMSO; conservare a -20 ° C. Preparare glucosio: Sciogliere glucosio nel mezzo di prova di stress glicolisi per formare una soluzione 250 mM; preparare fresco prima di ogni esperimento e non congelare. Preparare 2-DG: Sciogliere solido 2-DG nel mezzo di prova di stress glicolisi per formare una soluzione di 500 mm; preparare fresco prima di ogni esperimento e non congelare. 2. La raccolta della milza e nei linfonodi di topi Eutanasia il mouse da CO 2 asfissia seguita da dislocazione cervicale. Spruzzare il mouse con il 70% di etanolo. Per la successiva isolamento delle cellule T, raccogliere la milza, cervicale superficiale, superficiali ascellare / profonda, mandibolare, inguinali, e linfonodi mesenterici. Per la successiva isolamento delle cellule B, raccolto solo la milza. NOTA: Utilizzare un armadio biosicurezza e mantenere gli organi raccolti in PBS o supporto RF10 in ghiaccio fino al trattamento. Utilizzare da laboratorio sterile e tecnica sterile per tutti i trattamenti e ISOLpassi inflazione. Tenere tutti i buffer e dei media sul ghiaccio per aumentare l'efficienza di isolamento e di ridurre la morte cellulare. Processing 3. Tissue Mettere un filtro 70 micron cellulare su un tubo conico da 50 ml e trasferire gli organi sul filtro. Per l'isolamento delle cellule T, unire tutti gli organi e B trasferimento isolamento delle cellule solo la milza. Utilizzando lo stantuffo di una siringa sterile da 3 ml, schiacciare il tessuto attraverso il filtro. Durante schiacciare, assicurarsi che il filtro e gli organi sono umidi in ogni momento e bagnare come richiesto con l'aggiunta di buffer di MS. Ciò sia mantenere la vitalità cellulare alta e prevenire l'intasamento del filtro. Dopo mashing, applicare 5-10 ml MS buffer per il filtro per aumentare il recupero delle cellule. Centrifugare la sospensione a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. (Effettuare tutte le ulteriori centrifugazioni in queste condizioni, se non specificato). Decantare il liquido e risospendere il pellet in 5 ml ACK tampone di lisi dei globuli rossi. Incubate per 5 minuti in ghiaccio per lisare i globuli rossi (globuli rossi devono essere rimossi perché interferiscono con la separazione magnetica). Aggiungere 10-20 ml MS tampone e centrifugare. Mettere un filtro cella di 30 micron in un tubo da 15 ml e il primo con 1 ml di MS tampone (questa filtrazione sarà rimuovere i detriti dalla lisi degli eritrociti). Decantare il liquido dal tubo centrifugato, risospendere il pellet in 5 ml MS tampone e farlo passare attraverso il filtro. Lavare il tubo iniziale con 4 ml di MS buffer per aumentare il recupero delle cellule, e utilizzare questo per sciacquare il filtro. Utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule, determinare il numero totale di cellule. Questo numero cellulare sarà utilizzata per determinare la quantità di reagenti separazione magnetici richiesti al punto 4. Se splenociti devono essere utilizzati nella successiva analisi flusso extracellulare, annullare il numero appropriato di cellule in questo momento. Centrifugare la sospensione e procedere alla separazione magnetica. splenociti Risospendere non utilizzatiper l'isolamento delle cellule B in 5 ml RF10 e tenere in ghiaccio fino a quando il test del flusso extracellulare. 4. Separazione magnetica di cellule B e cellule T CD4 Naïve Determinare i volumi necessari di cocktail di biotina-anticorpo, microsfere anti-biotina, e buffer di MS. Utilizzare i seguenti volumi per 10 a 8 celle da guida e scalare verso l'alto o verso il basso, se necessario. NOTA: incubare i campioni in frigorifero piuttosto che sul ghiaccio da incubazione su ghiaccio può ridurre l'efficienza degli anticorpi di legame e potrebbero essere necessari tempi di incubazione più lunghi. Reagenti per ingenuo separazione delle cellule T CD4 + Volume per 10 a 8 celle (scala in modo appropriato) cocktail biotina-anticorpo 100 pl buffer di MS per prima incubazione 400 ml microsfere anti-biotina 200 ml microsfere CD44 100 pl buffer di MS per seconda incubazione 200 ml Incubare il cocktail e le cellule biotina-anticorpo a 4 ° C per 5 min. Aggiungere microsfere anti-biotina, microsfere CD44, MS tampone e incubare a 4 ° C per 15 min. Tabella 1: volumi e le istruzioni di isolamento delle cellule T. Reagenti per la separazione delle cellule B Volume per 10 a 8 celle (scala in modo appropriato) cocktail biotina-anticorpo </td> 100 pl buffer di MS per prima incubazione 400 ml microsfere anti-biotina 200 ml buffer di MS per seconda incubazione 300 microlitri Incubare il cocktail e le cellule biotina-anticorpo a 4 ° C per 15 min. Aggiungere il volume appropriato di cocktail biotina-anticorpo e il buffer MS, ed incubare la miscela a 4 ° C per 15 min. Aggiungere il volume appropriato di microsfere anti-biotina e MS tampone ed incubare la miscela a 4 ° C per 15 min. Dopo la seconda incubazione, riempire il tubo con tampone MS e centrifugare. Tabella 2: volumi e le istruzioni di isolamento delle cellule B. Risospendere il pellet in tampone MS: 500 microlitri per la separazione manuale, 3-4 ml per la separazione automatica. Continuare sia con separazioni manuali o automaticiCome segue: Separazione manuale: Inserire una colonna LS nel magnete di separazione, inserire un tubo conico sterili 15 ml di sotto per raccogliere il flusso attraverso, e il primo la colonna mediante lavaggio con 3 ml di tampone di MS. Gettare il flusso attraverso. Trasferire la sospensione cellulare alla colonna LS innescato e farlo passare attraverso; lavare il tubo utilizzato durante l'incubazione con 3 ml di MS tampone e passare questo attraverso la colonna pure. L'eluato conterrà le cellule purificate. Per l'isolamento delle cellule B, passare le cellule purificate attraverso la colonna una seconda volta in un nuovo tubo 15 ml, e ripetere la fase di lavaggio. Ciò aumenterà purezza e resa. Separazione automatizzato: Accendere il separatore automatico e controllare i livelli di gestione del buffer, soluzione di risciacquo e il 70% di etanolo. Assicurarsi che il rifiuto è vuoto prima di iniziare la separazione. Selezionare il rack refrigerate appropriata a seconda della dimensione del tubo di tegli campione non depurate (ad esempio, 15 ml). Al fine di mantenere le cellule vitali durante il processo di separazione, utilizzare rastrelliere che sono stati precedentemente raffreddati a 2-8 ° C per 3-4 ore, o fino a quando il refrigerante diventa solido. Montare il rack raffreddato sul palco del campione del separatore automatico. Posizionare il tubo campione nello slot A1, un tubo per la frazione negativo nello slot B1, e un tubo per la frazione positiva in C1. Se la raccolta di più di un campione, posizionare provette in colonne successive (A2, B2, C2, etc.). Selezionare la scheda di separazione sul touchscreen, e indicano la disposizione dei tubi sul rack. Dal menu di separazione, selezionare il programma "esaurisce" e completare il ciclo del programma con il tipo appropriato di lavaggio (vedi nota sotto). NOTA: il programma "esaurisce" svolge esaurimento utilizzando la modalità più sensibile della macchina, che privilegia la purezza. Inoltre, ci sono tre diverse opzioni di lavaggio: quick lavare, risciacquare, e dormire. Se i campioni sono dalla stessa fonte e devono essere combinati, seleziona risciacquo rapido. Se i campioni devono essere tenuti separati, selezionare risciacquo. Selezionare l'opzione di sonno se non ulteriori isolamenti saranno effettuate quel giorno e se la macchina si chiuderà dopo l'isolamento Avviare l'isolamento premendo il tasto "Esegui" e confermare i livelli di buffer quando richiesto. Dopo che il programma è terminato, la frazione negativo conterrà cellule purificate. Riempire il tubo conico fino a 15 ml con MS tampone e centrifugare. Decantare il MS tampone e risospendere le cellule in 5 ml supporto RF10. Mantenere le cellule in ghiaccio fino a quando il test del flusso extracellulare. NOTA: Idealmente, il saggio flusso extracellulare deve essere effettuata immediatamente dopo l'isolamento. Tuttavia, in esperimenti preliminari non sono state osservate differenze significative nei risultati del test in cellule utilizzate nel raggio di 3 ore di isolamento rispetto a quelli appena isolati. <p class = "jove_title"> 5. Extracellulare Flux Assay NOTA: Il protocollo descritto qui è per il formato a 96 pozzetti dello strumento. I volumi dovranno essere adeguati se si utilizza un altro formato. L'idratazione della cartuccia sensore Sollevare la cartuccia della sonda, riempire ciascun pozzetto della piastra di servizio con 200 ml di soluzione calibrante e abbassare la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità, immergendo i sensori nella soluzione calibrante. NOTA: verificare che il livello della soluzione calibrante è abbastanza alto per mantenere i sensori sommerse. La cartuccia porti fluorofori associati a O 2 e H + per ogni bene; questi devono essere idratati in modo per loro di lavorare correttamente. Posizionare la cartuccia in un 37 ° C incubatore non integrato con CO 2 o ossigeno / azoto. Effettuare tutte le ulteriori fasi di incubazione in queste condizioni, se non diversamente specificato. Incubare la cartuccia durante la notte per idratare. preparzione di Piastre adesivizzato Preparare 2,5 ml di una / ml soluzione adesiva 22,4 mg in 0,1 M di bicarbonato di sodio, pH 8,0 (bicarbonato fornisce il pH ottimale per l'adsorbimento adesivo). Applicare 25 microlitri della soluzione a ciascun pozzetto della piastra dosaggio e incubare sul banco a temperatura ambiente per 20 min. Aspirare adesivo e lavare ogni pozzetto due volte con 200 ml di acqua sterile. Attendere fino a quando i pozzi sono asciutti prima della semina le cellule. Semina cellule in piastre adesive rivestite Centrifugare le cellule a temperatura ambiente a 200 xg per 5 min. Risospendere le cellule in 5 ml di terreno di coltura appropriato (vedi sopra per la formulazione di stress mitocondriale e mezzi di sollecitazione glucosio). cellule centrifuga di nuovo e risospendere alla concentrazione desiderata nel terreno di coltura (volume risospensione variano in funzione della concentrazione; ogni pozzetto conterrà 180 ml di sospensione cellulare). NOTA: Fino a quando i mezzi di comunicazione di analisi appropriati e compounds vengono utilizzati, l'analizzatore di flusso extracellulare in grado di eseguire simultaneamente i test mitocondriale e lo stress glicolisi sulla stessa lastra. Piastra 180 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto. Utilizzare pozzi A1, A12, H1, e H12 per lo sfondo correzione della temperatura: aggiungere 180 ml di terreno di coltura in questi pozzi (senza celle). Incubare le piastre per 25 minuti a 37 ° C. Centrifugare la piastra a 200 xg per 5 min senza freno per garantire che tutte le cellule hanno completamente attaccato. Visivamente confermano che le cellule sono stabilmente aderenti alla superficie coltura, formando un monostrato, visualizzando al microscopio. Trasferire le piastre indietro al incubatore per altri 30 min. Preparazione di 10x concentrazioni di composti, e caricamento dei porti iniettori Per il test di stress mitocondriale, preparare 2,5 ml ciascuna di 10 oligomicina mM, 1 mM DNP, ed una miscela di 10 pM rotenone e 10 pM antimicina A, tutti in mitocondriale mediu test di stressm. NOTA: La concentrazione di 2,4-DNP si basa su studi precedentemente pubblicati, 21 questa è una linea guida generale, ma la concentrazione di sganciamento per ogni tipo di cellula utilizzato dovrebbe essere determinato dal ricercatore. Per lo stress test glicolisi, preparare 2,5 ml ciascuna di 250 mm di glucosio, 10 micron oligomicina, e 500 mm 2-desossiglucosio (2-DG) in terreno di coltura di stress glicolisi. Caldo 10x soluzioni a 37 ° C, e aggiustare il pH a 7,4. Caricare i composti nelle porte iniettori adatti della cartuccia utilizzando una micropipetta multicanale e le guide di carico, come segue: porto Mitocondriale Assay stress Glicolisi stress test UN 20 l oligomicina 20 ml di glucosio B 22 ml 2,4-DNP 22 ml oligomicina C 25 ml antimicina A / rotenone 25 ml 2-DG Tabella 3: i volumi composti. NOTA: Ogni serie di porte (ad esempio, tutte le porte A) devono contenere lo stesso volume. È fondamentale che tutti i pozzetti di una stessa serie sono caricati, anche quelli non utilizzati nell'esperimento, altrimenti non verranno iniettati composti (porti pozzetti non possono essere caricati con lo stesso volume di terreno di coltura). Incubare la cartuccia durante l'impostazione del programma. Impostazione extracellulare Flux Assay Protocolli Impostare il seguente programma (Tabella 4). Passo Ciclo continuo </tr> Calibrazione – Equilibration – letture di base 3 volte: MIX 3 min, attendere 0 min, misura 3 min Loop End – Iniettare Port A – misure 3 volte: MIX 3 min, attendere 0 min, misura 3 min Loop End – Iniettare Port B – misure 3 volte: MIX 3 min, attendere 0 min, misura 3 min Loop End – Iniettare Port C – misure 3 volte: MIX 3 min, attendere 0 min, measure 3 min Loop End – Programma fine – Tabella 4: il layout del programma. NOTA: in determinate condizioni, ad esempio, quando si utilizza cellule attivate, l'acidificazione può continuare più a lungo rispetto alle cellule naive. Per questo motivo, può essere necessario estendere le "wait" tempi nel programma precedente o ripetere ciascun ciclo di misura più volte. Iniziare il programma. Dopo la fase di calibrazione, sostituire la piastra calibrante per la piastra di test (quando richiesto). NOTA: Utilizzando il software, è possibile indicare gruppi di pozzi che hanno condizioni simili. Inoltre, è fondamentale indicare quali pozzetti sono i pozzetti di controllo (in questo protocollo, sono i quattro angoli della piastra) e per indicare quali pozzi sono vuoti. Per una più dettagliata, step-by-step, il protocollo per l'impostazione della macchina esoftware s, sito Web del produttore dovrebbe essere consultato. Misurare contenuto proteico Rimuovere il terreno di coltura residuo da ogni pozzetto senza disturbare le cellule. NOTA: Se non è conveniente procedere con il test concentrazione di proteine, è possibile bloccare l'intera piastra a -20 ° C fino all'analisi. Se congelato, scongelare prima di continuare. Preparare una soluzione 1x di inibitori della proteasi (100x magazzino) in media lisi RIPA (sufficiente per 50 ml / pozzetto). Aggiungere 50 ml di media RIPA lisi integrato con inibitori della proteasi in ciascun pozzetto. Agitare piastra su un agitatore per 5 minuti e quindi incubare piastra su ghiaccio per 30 minuti per lisare cellule completamente. Spin la piastra a 200 xg per 5 min a temperatura ambiente per portare lipidi e altre molecole per il fondo della piastra in modo che non interferiscano con il test dell'acido bicinconinico (BCA). Misurare la concentrazione di proteine ​​mediante saggio BCA secondo il fornitore &# 39; s raccomandazioni.