一种优化的协议分析和糖酵解线粒体呼吸的淋巴细胞

所有动物实验按照LIG-4的动物的协议，这是经NIAID动物护理和使用委员会进行。 1.试剂的制备制备磁分离（MS）的缓冲液：补充有0.5％BSA和2mM EDTA或补充有0.5％BSA的自动分离溶液的PBS（pH7.2）中。无菌过滤器（0.22微米），并储存在2-8°C。 制备RF10培养基：RPMI1640培养基补充有10％热灭活胎牛血清，50U / ml青霉素，50μM链霉素，1mM的丙酮酸钠，2mM的L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸，50μM2-巯基乙醇，10mM的HEPES。用消毒试剂。无菌过滤器并储存在2-8°C。 制备线粒体压力测试介质：补充有1mM丙酮酸钠，2mM的L-谷氨酰胺和25mM葡萄糖XF基础培养基。 准备糖酵解压力测试介质：XF基本培养基supplemen泰德了2mM L-谷氨酰胺。 同时调整线粒体和糖酵解压力测试介质的pH到7.4，无菌过滤器和储存在2-8℃。温暖的媒体至37°C和重新调整pH之前使用（进行测量pH值在37°C）。 注意：使用XF介质，它缺乏碳酸氢盐，是至关重要的。由于在细胞外磁通分析器气氛仅包含环境CO 2，在介质中的任何碳酸氢盐，结合后释放糖酵解的副产品质子，将解离，以形成二氧化碳和水。 的 CO 2将在实验过程中脱气，引起pH值的漂移，将模糊糖酵解酸化信号。 寡准备：准备10毫米DMSO原液;保存在-20℃。 准备2,4-DNP：准备在DMSO 1M的原液;保存在-20℃。 准备抗霉素A：准备10毫米DMSO原液;保存在-20℃。 鱼藤酮准备：准备10毫米小号在DMSO滴答的解决方案;保存在-20℃。 准备葡萄糖：溶在糖酵解压力测试介质葡萄糖以形成250mM的溶液;准备每次实验前新鲜和不冻结。 制备2-DG：将固体2-DG在糖酵解压力测试介质中以形成一个500毫溶液;准备每次实验前新鲜和不冻结。 2.收获脾和淋巴结小鼠安乐死用CO 2窒息之后颈脱位鼠标。 喷用70％乙醇鼠标。 对于随后的T细胞的分离，收获了脾，颈浅的，肤浅/渊腋，下颌骨，腹股沟，和肠系膜淋巴结。 对于后续的B细胞分离，只收获了脾脏。 注：使用生物安全柜，并保持收获的器官在PBS或RF10媒体上的冰上，直到处理。使用无菌实验室器皿及无菌技术为所有的处理和ISOL通货膨胀步骤。置于冰上所有缓冲区和媒体，以增加隔离效率，减少细胞死亡。 3.组织处理放置一个70微米的细胞滤网超过50ml锥形管和器官转移到过滤器。对于T细胞的分离，结合所有的器官和B细胞隔离变换仅脾脏。 从无菌3毫升注射器使用柱塞，通过过滤醪组织。糖化过程中，确保过滤器和器官是在任何时候都湿润，并根据需要加入MS缓冲弄湿。这将既保持细胞生存力高和防止过滤器的堵塞。 捣碎后，取5〜10毫升缓冲MS的过滤器，以增加细胞恢复。离心该悬浮液在400×g离心在4℃下5分钟。 （进行所有进一步离心这些条件下，除非另有说明）。 倒出液体并重新悬浮于5毫升的ACK红细胞裂解缓冲液沉淀。 INCU软化在冰上5分钟，以裂解红血细胞（红血球需要被去除，因为它们与磁分离干扰）。添加10-20毫升MS缓冲和离心。 放置一个30微米的细胞过滤器在15毫升的锥形管和总理就用1毫升MS缓冲（这将过滤从红细胞裂解清除杂物）。倒出从离心管中的液体，重悬沉淀在5ml MS缓冲，并使之通过过滤器。洗净初始管用4ml MS缓冲增加细胞恢复，并用它来冲洗过滤器。 使用血细胞计数器或自动细胞计数器，确定细胞的总数。此细胞数将被用于确定如果脾细胞是在随后的胞外通量测定法中使用在第4部分所需磁选试剂的量，预留的细胞的适当数量的在这个时候。 离心悬挂和进行磁选。悬浮脾不使用对于在5毫升RF10 B细胞的分离和保持在冰上，直到外通量分析。 4，B细胞和幼稚的CD4 + T细胞磁选确定生物素抗体混合物，抗生物素微珠，和MS缓冲器的必要容量。使用10 8个细胞以下几卷作为指导和放大或缩小是必要的。 注：孵育样品在冰箱中，而不是在冰上自孵育在冰上可减少抗体结合效率和可能需要较长的温育时间。 试剂幼稚CD4 + T细胞分离 为10 8个细胞体积 （适当的比例） 生物素标记抗体鸡尾酒 100微升 MS缓冲区第一孵化 400微升抗生物素微珠 200微升 CD44微珠 100微升 MS缓冲区第二培育 200微升孵育在4℃下的生物素 – 抗体混合物和细胞5分钟。添加抗生物素微珠，CD44微珠，质谱缓冲，并在4℃下孵育15分钟。 表1：T细胞分离的卷和指令。 试剂B细胞分离 为10 8个细胞体积 （适当的比例） 生物素标记抗体鸡尾酒</TD> 100微升 MS缓冲区第一孵化 400微升抗生物素微珠 200微升 MS缓冲区第二培育 300微升孵育在4℃下的生物素 – 抗体混合物和细胞15分钟。添加生物素抗体混合物和MS缓冲器的适当体积，并在4℃下孵育该混合物15分钟。添加抗生物素微珠的适当体积和MS缓冲液在4℃下孵育该混合物15分钟。第二次温育之后，填充与MS缓冲器和离心试管。 表2：B细胞隔离卷和指令。 在重悬缓冲MS颗粒：500微升手动分离，3-4毫升自动分离。 无论是用手动或自动离职继续如下： 手动分离： 插入一个LS柱进入分离磁铁，放置在下面一个无菌的15毫升锥形管通过用3ml的MS缓冲液洗涤，收集通过素柱的流动，和。丢弃通过流。 细胞悬液转移至涂底漆的LS柱，并允许它通过;洗用3ml的MS缓冲和传递此通过该柱，以及温育过程中使用的管。洗脱液将包含纯化的细胞。 B细胞分离，在第二时间经过纯化的细胞通过该柱到一个新的15ml试管中，并重复洗涤步骤。这将增加的纯度和产率。 自动分离： 开关上的自动分离器，并检查运行缓冲液，冲洗液和70％乙醇的含量。确保废物是在开始分离之前空。 根据T的管的尺寸选择合适的冷藏架他未纯化样品（ 例如 ，15毫升）。为了保持整个分离过程可行的细胞，使用已在2-8℃下预先冷却3-4小时机架，或直到冷却剂变成固体。 安装在自动分离装置的样品台的冷冻架上。 放置在插槽A1，对于在时隙B1中阴性部分的管样品管，以及用于在C1上的正部分的管。如果收集多个样品，放置在下一列（A2，B2，C2， 等等 ）的其他管中。 选择在触摸屏上的分离标签，并指示在机架管的布置。从分离菜单中，选择“耗尽”程序，并完成与适当类型洗涤程序周期（参见下面的注释）。 注意：“耗尽”计划执行使用机器的最敏感的模式，优先纯度枯竭。此外，有三种不同的洗涤选项：QUICķ漂洗，和睡眠。如果样本是从同一源和将被组合，选择快速冲洗。如果样本将被分开，选择冲洗。选择睡眠选项，如果没有进一步的隔离将开展那一天，如果机器将被关闭以下隔离按“运行”，启动隔离和提示时确认缓冲水平。程序结束后，负分数将包含纯化的细胞。 填充锥形管高达15毫升MS缓冲和离心机。 倒出该MS缓冲液和悬浮细胞在5ml RF10介质。保持细胞在冰上，直到外通量分析。 注：在理想情况下，胞外通量测定法，应立即在分离后进行。然而，在初步实验中隔离与新鲜分离的人的3小时内使用的细胞中观察到在测定结果没有显著差异。 <p class ="“jove_title”"> 5。外通量分析注意：此处所概述的协议是用于仪器的96孔格式。卷将需要进行调整，如果使用另一种格式。 传感器盒的水化抬起传感器盒，填充用200μl的校准溶液的效用板的各孔，并降低传感器盒上的效用板，浸入传感器中的校准溶液。 注：验证校准解决方案级别足够高，以保持淹没传感器。墨盒港口关联O 2和H +每口井的荧光;这些都需要以水合为他们正常工作。 放置盒式磁带在37℃培养箱中未补充的 CO 2或氧/氮。执行所有进一步孵化这些条件下，除非另有说明。孵育墨盒一夜之间水合物。 Prepar胶涂层板的通货膨胀在0.1M碳酸氢钠制备2.5 22.4微克/毫升粘合剂溶液中，pH为8.0（碳酸氢盐为粘合剂吸附最适pH）。 应用25微升溶液到测定板的每个孔中，并在室温下在工作台上孵育20分钟。 抽吸粘合剂和洗涤各孔两次使用200微升无菌水。等到井接种细胞前，干燥。 在胶粘剂涂层板的种子细胞离心细胞以在200×g离心5分钟，室温。在5毫升的合适的测定介质的悬浮细胞（见上文线粒体应力和葡萄糖应力介质的制剂）。再次离心细胞，并重新悬浮在测定培养基中的所需浓度（悬浮体积将取决于浓度;每个孔将包含180微升细胞悬浮液）。 注意：只要适当测定培养基和化合物s的所使用的，细胞外的磁通分析仪可以同时运行在同一板上的线粒体和糖酵解压力测试。 板180微升细胞悬浮液在每个孔中。使用井A1，A12，H1和H12为背景温度校正：加180微升测定培养基中这些孔（无细胞）。 在37℃下孵育板25分钟。 离心板在200×g离心5分钟，没有制动，以确保所有细胞已完全附着。目视确认该细胞被稳定地附着于培养物表面，形成单分子层，通过在显微镜下观察。转移板回培养箱另外的30分钟。 化合物的浓度10倍的制备和喷油港口装载对于线粒体压力测试，准备2.5毫升10μM寡，1毫米DNP，和10μM鱼藤酮和10μM抗霉素A，所有的线粒体压力试验mediu的混合物米注：2,4-DNP的浓度是基于先前发表的研究; 21，这是一般的准则，但解偶联剂的用于使用应该由研究人员来确定每种细胞类型的浓度。 对于糖酵解压力测试，准备2.5毫升250毫米的葡萄糖，10μM寡，而在糖酵解压力测定介质500毫摩尔2-脱氧葡萄糖（2-DG）的。 温暖10倍溶液至37℃，并调节pH至7.4。 加载化合物成使用多通道移液器和装载导轨盒的合适注射器端口，具体如下： 港口 线粒体应力分析 糖酵解应力分析 一个 20微升寡 20微升葡萄糖乙 22微升2,4-DNP 22微升寡 C 25微升抗霉素A /鱼藤酮 25μl的2-DG 表3：化合物卷。 注：每个系列的端口（ 例如 ，所有的端口A）必须包含相同的音量。至关重要的是，在一个给定系列中的所有孔中被加载，即使是那些在实验中不使用，否则这些化合物将不会被注入（在未使用的孔中的端口可以装入相同体积的测定培养基的）。 孵育盒在设置程序。 设置外通量分析协议设置了下面的程序（ 见表4）。 步 循环 </tR> 校准 – 平衡 – 基准读数 3次：混合3分钟，等待0分钟，测量3分钟结束循环 – 注射端口A – 测量 3次：混合3分钟，等待0分钟，测量3分钟结束循环 – 注射端口B – 测量 3次：混合3分钟，等待0分钟，测量3分钟结束循环 – 注射端口C – 测量 3次：混合3分钟，等待0分钟，测量电E 3分钟结束循环 – 程序结束 – 表4：项目布局。 注意：在某些情况下， 例如 ，使用活化细胞时，酸化可能持续超过幼稚细胞更长。因为这个原因，它可能有必要在上述程序扩展的“等待”时间或重复在每个测量周期更多次。 开始的程序。校准步骤后，（提示时）更换校准板分析板。 注意：使用的软件，它可以指示具有类似条件井组。此外，它是指示哪些井对照孔关键（在这个协议中，它们是在板的四角），并指示哪个孔是空的。有关更详细的，一步一步，协议设置机器和它的软件，制造商的网站，应咨询。 测量蛋白质含量除去从各孔中剩余的测定培养基而不干扰细胞。 注意：如果它是不方便的蛋白质浓度测定来进行，也可以在-20℃直至分析冻结整个板。如果冻结，继续之前解冻。 制备蛋白酶抑制剂的在RIPA裂解介质1倍溶液（100×股票）（足够用于50μl/孔）。 添加补充有蛋白酶抑制剂，以每孔50微升的RIPA裂解介质。搅动上5分钟摇动板，然后孵育板在冰上进行30分钟至完全裂解细胞。 旋板在200×g离心5分钟，在室温下使脂质和其它分子到板的底部，以便它们不与二辛可宁酸（BCA）测定干扰。 根据制造商通过BCA测定测量蛋白质浓度和＃39;的建议。