A Plataforma de Ensaios Anti-biofilme adequado para a Exploração de bibliotecas de compostos naturais

As bactérias podem alternar entre dois estilos de vida muito diferentes, planctônicas e sessile, dos quais um biofilme é o exemplo mais comum. Em biofilmes, as bactérias formarem comunidades estruturadas embebidas numa matriz auto-produzido ^um. Esta matriz auto-produzido é uma barreira entre as bactérias e seu ambiente externo, e que protege as células microbianas, mantê-los na proximidade. A composição da matriz do biofilme varia entre e dentro das espécies, mas a maioria é constituída de uma forte rede de lipopolissacarídeos, ADN extracelular e proteínas. A matriz serve como uma barreira física inibir a entrada de agentes nocivos, mas também protege o biofilme de desidratação e impede que os nutrientes se escape da célula ^2.

Os biofilmes são considerados como um dos temas mais desafiadores da biomedicina moderna, e eles são supostamente responsáveis por mais de 80% das infecções antibióticos tolerante ^3. eles dispestabelecer uma tolerância inerentemente alta contra ameaças externas: umidade, pressão osmótica, estresse mecânico ^4, calor, radiação UV ^5, desinfectantes, agentes antimicrobianos e o sistema imune do hospedeiro ^1. Por exemplo, a concentração de agente antimicrobiano necessária requerida para matar um biofilme tem sido mostrado para ser de até 1000 vezes mais elevada em comparação com a necessária para matar bactérias planctónicas. A explicação para essa maior tolerância parece ser multifatorial. A matriz proporciona uma barreira física que reduz a penetração de antibióticos para o biofilme. Além disso, as células dentro dos biofilmes são fenotipicamente diversificada; eles transição entre diferentes estados metabólicos devido a um gradiente existente de oxigénio, nutrientes, metabolitos e entre as partes interior e exterior do biofilme ^6. Assim, em algumas regiões do biofilme, como o núcleo, as bactérias são privadas de oxigênio e nutrientes e vive em um metabolicamente menos ativo ou um estado completamente adormecida <sup> 7. As células totalmente dormentes são referidas como células Persister, e eles não são sensíveis a tratamentos antimicrobianos convencionais ^8. Assim, é provável que o biofilme resiliência surge a partir de uma combinação dos mecanismos presentemente sugeridas e outras, ainda desconhecidos,. Staphylococcus spp. ainda estão entre as bactérias gram-positivas mais problemáticas, causando graves, muitas vezes relacionados com o biofilme, infecções ^4. Sugere-se que até 99% de todas as bactérias estão associadas dentro de biofilmes, tornando-o estilo de vida bacteriana predominante ^3. No entanto, todos os antibióticos actualmente existentes têm sido desenvolvidos contra bactérias unicelulares (planctônicas). Até agora, um repertório limitado de moléculas que existe pode actuar selectivamente em biofilmes maduros. Esta situação tem impulsionado uma mudança de paradigma progressivo na descoberta de medicamentos, em que a procura para os anti-biofilme tem sido instado a ocupar um lugar mais proeminente.

De um methodologperspectiva iCal, existem desafios adicionais, já que apenas um número limitado de métodos de biofilme foram desenvolvidos por organizações de normalização, especialmente aqueles aplicáveis ​​ao rastreio de alto rendimento de bibliotecas químicas. Todos os ensaios normalizados (com apenas uma excepção) baseiam-se em reactores de biofilme, e estes métodos requerem grandes volumes de trabalho e grandes quantidades de compostos a serem testados, que são normalmente não disponível durante a fase precoce investigacional ^9-12. O ensaio de rastreio-aplicável padronizado única existente é o assim chamado dispositivo de Calgary biofilme, a partir do qual o sistema disponível comercialmente biofilme eliminando concentração mínima (MBEC) foi desenvolvido ^13-15. No entanto, a limitação deste ensaio é que os biofilmes são cultivadas em estacas, e nem todas as espécies bacterianas ou mesmo estirpes da mesma espécie são capazes de formar biofilmes sobre este dispositivo. Além disso, os métodos que podem ser especialmente aplicados para a exploração de compostos naturais sãonecessário. Produtos naturais têm sido a principal fonte de inovação na descoberta de medicamentos antimicrobianos durante o último século ^16. Eles podem fornecer compostos anti-biofilme com novos mecanismos de acção único que também pode ser eficaz contra células Persister. Assim, a exploração de bibliotecas naturais e inspirados na natureza tem grandes chances de produzir leads anti-biofilme promissores e originais.

Aqui, apresentam-se os pormenores experimentais de uma plataforma de ensaios que foi desenvolvido para o rastreio de compostos químicos anti-biofilme usando três ensaios para medir os efeitos sobre a viabilidade, a biomassa total, e a matriz do biofilme Staphylococcus aureus. O primeiro ensaio mede a viabilidade do biofilme, e que se baseia na coloração resazurina. Resazurina é um corante redox azul e que é não fluorescente no seu estado oxidado e transforma-se em cor de rosa resorufina, altamente fluorescente quando reduzida pela actividade metabólica das bactérias. É um m muito simples e rápidoétodo adequado para exames preliminares ^17-20. O segundo ensaio, com base na coloração de violeta de cristal, mede massa total do biofilme. Cristal violeta é uma mancha amplamente utilizado para estudar as bactérias e bactérias em biofilmes ^19,21-23. O ensaio baseia-se reagentes baratos e tem um ponto de extremidade simples leitura de absorvância. Finalmente, o terceiro ensaio tem como alvo o -matrix extracelular substância polimérica (EPS) do biofilme através de aglutinina de gérmen de trigo (WGA), que se liga especificamente a poli- resíduos de glucosamina N-acetil-(PNAG) presentes na matriz do biofilme estafilocócicas ^24. A WGA é conjugado com um fluoróforo, que pode ser detectado utilizando leitores de intensidade de fluorescência ^25. Apresentamos aqui a lógica e os detalhes da plataforma que desenvolvemos, incluindo exemplos de aplicações.