Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Lena Lavie; Larissa Dyugovskaya; Andrey Polyakov; Oksana Rogovoy; Eva Leder

doi:10.3791/54826

JoVE Journal > Immunology and Infection

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免疫与感染

Sviluppo e identificazione di una sottopopolazione romanzo di Human neutrofili di derivazione fagociti Giant In Vitro</em

Published: January 25, 2017

doi:

10.3791/54826

Lena Lavie¹, Larissa Dyugovskaya¹, Andrey Polyakov¹, Oksana Rogovoy¹, Eva Leder¹

¹The Lloyd Rigler Sleep Apnea Research Laboratory, Unit of Anatomy and Cell Biology, The Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine,Technion-Israel Insitute of Technology

Summary

Descriviamo qui un metodo per ottenere e identificare una sottopopolazione di recente caratterizzato dei fagociti giganti neutrofili derivato. Queste cellule si sviluppano in cultura da freschi neutrofili sangue umano, e sono caratterizzati da fagocitosi, l'autofagia, immensamente grandi dimensioni, e la durata della vita estesa. Questo metodo è fondamentale per approfondire questo unico sottopopolazione neutrofili-derivati.

Abstract

I neutrofili (PMN) sono più noti per le loro funzioni fagocitarie contro l'invasione patogeni e microrganismi. Hanno il più breve emivita tra leucociti e nel loro stato non attivato sono costitutivamente impegnati per apoptosi. All'atto dell'assunzione di siti infiammatori per risolvere l'infiammazione, che producono una serie di molecole citotossiche con potenti uccisione antimicrobica. Tuttavia, quando queste potenti molecole citotossiche sono rilasciate in modo incontrollato possono danneggiare i tessuti circostanti. Negli ultimi anni, tuttavia, la versatilità dei neutrofili è sempre più evidenziata, dimostrando le funzioni di plasticità e immunomodulanti. Abbiamo recentemente identificato una nuova sottopopolazione neutrofili derivato, che si sviluppa spontaneamente in condizioni standard di coltura senza aggiunta di fattori di citochine / crescita come granulociti fattore stimolante le colonie (GM-CSF) / interleuchina (IL) -4. Le loro capacità fagocitaria dei neutrofili resti in gran parte contribuiscono ad aumentare la lorodimensioni immensamente; fagociti giganti perciò furono chiamati (Gφ). A differenza di neutrofili, Gφ sono vissuto a lungo in coltura. Essi esprimono il cluster di differenziazione (CD) marker neutrofili CD66b / CD63 / CD15 / CD11b / mieloperossidasi (MPO) / neutrofila (NE), e sono privi della monocitica marcatori lignaggio CD14 / CD16 / CD163 e gli indicatori CD1c / CD141 dendritiche . Hanno anche prendere-up lattice e zymosan, e rispondono burst ossidativo alla stimolazione con opsonizzati-zymosan e PMA. Gφ anche esprimere il scavenger recettori CD68 / CD36, ea differenza di neutrofili, interiorizzare ossidato-lipoproteine a bassa densità (oxLDL). Inoltre, a differenza neutrofili freschi, o monociti in coltura, rispondono a oxLDL assorbimento da un aumento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS). Inoltre, questi fagociti contengono associata ai microtubuli proteina-1 catena leggera 3B (LC3B) vacuoli rivestiti, indicando l'attivazione dell'autofagia. Utilizzando inibitori specifici, è evidente che sia la fagocitosi e l'autofagia sono prerequisiTES per il loro sviluppo e probabilmente NADPH ossidasi dipendente ROS. Descriviamo qui un metodo per la preparazione di questa nuova sottopopolazione di lunga vita, fagociti neutrofili derivate in coltura, l'identificazione e le caratteristiche attualmente conosciuti. Questo protocollo è essenziale per ottenere e caratterizzare Gφ al fine di approfondire il loro significato e le funzioni.

Introduction

neutrofili polimorfonucleati (PMN) costituiscono la più grande popolazione di leucociti nel sangue, che serve come prima linea di difesa contro l'invasione patogeni producendo una vasta gamma di molecole citotossiche. La visione tradizionale è da tempo che di sangue circolante, di breve durata, fagociti professionali, che sono i primi ad arrivare a siti infiammatori acuti per combattere le infezioni e gli aiuti nella clearance di agenti patogeni e particelle nocive. ¹ Nel loro stato non attivato, i neutrofili sono costitutivamente impegnati apoptosi. Durante la migrazione dal sangue a siti infiammatori, i neutrofili sono sottoposti attivazione per risolvere l'infiammazione. Essi fagocitano e uccidono microrganismi invasori, producendo una serie di molecole citotossiche specie di ossigeno reattive come (ROS), enzimi litici quali neutrofili elastasi (NE) e cathepsins con potente attività microbicida. Al fine di intrappolare gli agenti patogeni, i neutrofili rilasciano anche trappole extracellulari (NET) Che consistono di fili cromatina nucleare contenenti peptidi antibatterici e vari enzimi litici. Tuttavia, rilascio incontrollato di queste molecole citotossiche dai neutrofili può anche perpetuare le risposte infiammatorie e indurre danni ai tessuti circostanti. ² Pertanto, un gioco efficace di neutrofili apoptotici da parte dei macrofagi (Mφ) e le cellule dendritiche (DC) è fondamentale per risolvere l'infiammazione. ^{^3,} ^{^4,} ^{^5,} ⁶

Negli ultimi anni, tuttavia, è diventato sempre più evidente che i neutrofili sono altamente versatili cellule, le cui funzioni vanno ben oltre la fagocitosi e uccisione degli agenti patogeni. ^{^6,} ⁷ Con sottoposti a priming o l'attivazione, neutrofili plasticità sta gradualmente guadagnando attenzione. Per esempio, i batteri e micobatteri sfidati neutrofili hanno dimostrato disecernono interleuchina (IL) -10 e controllare la risposta infiammatoria, suggerendo la presenza di risposte immuno-normativo. ⁸ neutrofili post-mitotico hanno dimostrato di trans-differenziarsi in cellule Mφ-like, o cellule DC-like da digerire e la presentazione di frammenti di antigene, se trattati con citochine e fattori di crescita, ^{^9,} ¹⁰ quindi, che serve un ruolo fondamentale nell'integrazione innata e adattiva risposte. ^{^3,} ⁶ Attivazione da fattori di crescita promosso engulfment di neutrofili apoptotici o detriti cellulari, di conseguenza, facilitare la liquidazione dei residui nei siti infiammatori e la risoluzione dell'infiammazione, ^{^3,} ⁹ in particolare quando il sistema di compensazione Mφ / DC è insufficiente o sopraffatti, ^{^11,} ¹² suggerendo potenziale 'autoregolazione' per aiutare rerisolvere la risposta infiammatoria. Questo, dal momento che l'apoptosi è una forma di auto-regolamentato morte che può inibire il rilascio extracellulare di composti citotossici e quindi prevenire lesioni ai tessuti circostanti. ⁶

la sopravvivenza prolungata è un'altra caratteristica di attivazione dei neutrofili ed è stato dimostrato dal trattamento con vari fattori dell'ospite derivato come il fattore di colonie di granulociti-stimolante (G-CSF), fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF), citochine infiammatorie come l'interferone ( IFN) -γ, fattore di necrosi tumorale (TNF) -a prodotti derivati e / o patogeni, in tal modo, permettendo neutrofili di modulare la risposta di sopravvivenza. ⁶ Infatti, neutrofili sopravvivenza è un prerequisito per la sua plasticità ed è stata associata con la sua capacità di eseguire la fagocitosi. ^{^6,} ¹³ Di conseguenza, è stato anche dimostrato di associarsi con fenotipiche e funzionali cambiamenti che Depended sull'espressione genica upregulated inducendo la sintesi di nuove proteine coinvolte in estensione la durata della vita dei neutrofili, e apoptosi diminuita. ¹⁰

A differenza di neutrofili che sono di breve durata e costitutivamente subiscono apoptosi nella cultura, o le neutrofili citochine / fattori di crescita-attivati, di cui sopra, che hanno esteso durata della vita, abbiamo recentemente identificato una nuova, piccola sottopopolazione di neutrofili che si sviluppa spontaneamente nella cultura di serie prolungata condizioni da appena isolate neutrofili del sangue umano senza l'aggiunta esternamente citochine o fattori di crescita. ¹⁴ fagociti giganti Queste cellule neutrofili di derivazione, che non sono stati descritti prima nella letteratura sono stati chiamati (Gφ). Il Gφ hanno esteso la durata della vita nella cultura, essi sono completamente sviluppati entro 5-7 giorni, e sono caratterizzati da caratteristiche morfologiche uniche, espressione fenotipica e funzioni. Essi sono notevolmente ingranditi a causa di autophagocitosi di resti neutrofili morti, vacuolate, e contenere phagolysosomes. Il Gφ esprimono il marcatore specifico granuli dei neutrofili – cluster di differenziazione (CD) 66b, i granuli azzurrofili marcatori – CD63 e mieloperossidasi (MPO) e neutrofili ulteriori marcatori, come CD11b, NE, CD15, la subunità NADPH ossidasi gp91- phox e p22- phox, e il marcatore -LC3BII autofagia. ^{^14,} ¹⁵ punto di vista funzionale, hanno attivamente take-up sfere di lattice e particelle zymosan, e generare ROS in risposta a zymosan e forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) stimolazione. È interessante notare che, a differenza di neutrofili freschi, Gφ anche intensamente esprimono i recettori scavenger CD68 e CD36, take-up ossidato lipoproteine a bassa densità (oxLDL), e generare ROS in risposta alla stimolazione con oxLDL. Inoltre, Gφ sono privi dei marcatori lignaggio monociti CD14, CD16 e CD163 o gli indicatori dendritiche CD1c e CD141. Inoltre, phagocytosis e autofagia e probabilmente NADPH ossidasi funzionale sono i presupposti per il loro sviluppo. Ciò in quanto, la fagocitosi-inibitore cytochalsin B, gli inibitori della autofagia 3 metiladenina (3-MA) e bafilomicina (BafA1) e l'inibitore della NADPH ossidasi – difenilen iodonio (DPI) – ha impedito il loro sviluppo. Inoltre, monociti / neutrofili co-culture così come l'esposizione a ipossia intermittente ostacolato il loro sviluppo, mentre l'adattamento dei neutrofili all'ipossia sostenuta era evidente. ^14,15 Il loro sviluppo suggerito nella cultura è illustrato nella figura 1 del protocollo .La nel presente documento descrive passo dopo passo la preparazione di Gφ dal fresco isolato neutrofili del sangue umano, il loro sviluppo, identificazione e alcune caratteristiche di base di circolazione. Questo protocollo può essere utilizzato per approfondire e rivelare lo spettro ampio e il ruolo di questi nuovi descritto e intrigante dei neutrofili derivato da Gφ al fine di characterizvia e il loro significato e le loro potenziali funzioni.

Figura 1: Rappresentazione schematica del gigante cellule Sviluppo in 7 Culture Day neutrofili. Si suggerisce che nei siti infiammatori (1) neutrofili subiscono la morte cellulare per apoptosi, e (2) il rilascio membrana circondato frammenti contenenti residui nucleari, granuli (verde e puntini rossi), ed altri costituenti subcellulari che innescano meccanismi di autofagia. (3) fagociti giganti (Gφ) sviluppano nelle culture dei neutrofili a lungo termine privi di citochine o fattori di crescita per l'internalizzazione corpi apoptotici e detriti neutrofili, pur mantenendo oxidase.They NADPH funzionale sono caratterizzati da vari neutrofila CD66b + / CD63 + / MPO + / CD15 + / CD11b + / marcatori NE, grandi phagosomes racchiudono granuli e detriti cellulari, e recettori scavenger CD36 e CD68. Gb1; sono per lo più le cellule mononucleate, in grado di internalizzare anche varie particelle e LDL ossidate e generare ROS. Le membrane dei vacuoli di riempimento Gφ contengono LC3B (segnato in blu scuro), un marker di membrana autophagosomal, suggerendo una stretta associazione tra autofagia e la formazione dei fagociti gigante. Gφ non sviluppano in terreno contenente GM-CSF / IL-4. Inoltre, inibitori, come l'inibitore della NADPH ossidasi – difenilen iodonio (DPI), gli inibitori autofagia 3 metiladenina (3-MA) e bafilomicina (BafA1) e l'inibitore fagocitosi citocalasina B (. Cito B) aboliscono la loro formazione. (4) I potenziali funzioni Gφ in vivo possono includere proprietà anti o pro-infiammatorie e la partecipazione ai processi aterosclerotici (questa cifra si basa sulle nostre scoperte ^{^14,} ¹⁵ ed è stato modificato dal editoriale di accompagnamento da BErton ^20). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Protocol

Il protocollo è stato approvato dal Comitato per i diritti umani locale secondo la dichiarazione di Helsinki, e tutti i partecipanti hanno firmato un modulo di consenso informato. 1. Isolamento dei neutrofili e Sviluppo di Gφ nella cultura NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite utilizzando sterile lipopolysaccaride grado di tessuto (LPS) soluzioni senza glutine in una cappa a flusso laminare Bio-sicurezza. Non aggiungere antibiotici, citochine o fattori di crescita per l'istituto parco memoriale Roswell (RPMI) -1640 media. Ottenere almeno 40 ml di sangue venoso da giovani adulti sani utilizzando un set vena del cuoio capelluto sterile. Disegnare il sangue in provette vacutainer contenente etilendiammina tetra acido acetico K 3 sale (K 3 EDTA) e mescolare delicatamente. Mantenere il sangue a temperatura ambiente. Isolare i neutrofili di due fasi gradiente di densità discontinuo usando polysucrose a 1.119 e 1.077 g / ml. Portare soluzioni a temperatura ambiente prima dell'uso. NOTA: Durante la centrifugazione, rosso sanguecellule (RBC) sono aggregati dal polysucrose e sedimenti rapidamente. Le cellule mononucleate (monociti / linfociti) si trovano tra il plasma superiore / polysucrose -1077 interfaccia, mentre i neutrofili si trovano appena sopra la globuli rossi, al polysucrose -1077 / 1.119 interfaccia (vedi figura 2). Questo metodo permette la separazione simultanea di cellule mononucleari e neutrofili dallo stesso individuo. Figura 2: L'isolamento dei neutrofili dal sangue intero umano. Polysucrose a 1,077 g / ml è accuratamente sovrapposto di polysucrose-1.119 g / ml per formare un gradiente discontinuo. Il sangue intero diluito viene quindi sovrapposto della polysucrose-1.077. I tubi sono immediatamente sottoposti a centrifugazione a 700 xg per 30 min a temperatura ambiente senza freno. Tre bande distinte sono noti. Polimorfonucleati (A), le cellule mononucleate, (B) (PMN),e (C) globuli rossi (RBC) al fondo della provetta. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Aggiungere 12 ml polysucrose-1119 al fondo di un 50 ml sterile provetta polipropilene conica. strato con cautela 12 ml di polysucrose-1077 sul polysucrose -1119. Diluire 10 – 12 ml di sangue intero in un volume finale di 24 ml di sangue con ioni fosfati salina tamponata (PBS) contenente 2% di calore inattivato siero fetale di vitello (FCS-HI). strato cautela 24 ml di sangue intero diluito sulla pendenza superiore del tubo. Centrifugare a 700 xg per 30 min a temperatura ambiente (20 – 24 ° C) senza freno. NOTA: centrifugazione a temperature inferiori può causare aggregazione cellulare e scarso recupero. Rimuovere con attenzione i tubi dalla centrifuga without disturbare il gradiente. Due strati opachi devono essere osservate (A: Le cellule mononucleari e B: PMN, raffigurati in Figura 2). Aspirare ed eliminare il liquido fino a 0,5 cm sopra strato A. Transfer (o scarto) le cellule da questo strato in una provetta contrassegnata "Mononuclear". Aspirare ed eliminare il liquido rimanente fino a 0,5 cm sopra strato B. Trasferire le cellule da questo strato in una provetta con l'etichetta "PMN". Pool PMN da ogni due tubi gradiente e lavare con PBS contenente 2% HI-FCS ad un volume finale di 30 ml. Centrifugare per 12 minuti a 200 xg, rimuovere il surnatante e gettarlo. Per sbarazzarsi di contaminanti globuli rossi (RBC), aggiungere 3 ml di ipotonica 0,2% di ghiaccio freddo sterile di NaCl mentre risospendere il pellet disegnando delicatamente dentro e fuori con un 1 ml sterile punta della pipetta. Tenere in ghiaccio per 30 sec. Dopo 30 s, ripristinare isotonicità aggiungendo 3 ml di soluzione sterile 1,6% ghiacciata NaCl al tubo. Per i 6 ml di soluzione salina isotonica, aggiungere 6 ml di pre-riscaldato (37 ° C) RPMI-1640 integrato con 2% HI-FCS e centrifugare a 250 xg per 12 min. Eliminare il surnatante. Il pellet PMN deve essere pulito di contaminazione RBC. NOTA: In caso di contaminazione da RBC, il pellet PMN appare rossastra. Se alcuni contaminanti RBC restano, ripetere i punti 9 e 10 una volta di più. Risospendere il pellet di cellule in 4 ml RPMI-1640 supplementato con 10% HI-FCS e contare le cellule per determinare la loro concentrazione e la vitalità con esclusione trypan blu. Regolare la concentrazione a 1,25 – 1,5 x 10 6 PMN / ml (a seconda delle esigenze sperimentali) e piastra 1,0 mL / pozzetto in una piastra 24 pozzetti. NOTA: La purezza dei neutrofili nella popolazione dei granulociti sempre superato il 95%, come valutato dal maggio Grunewald-Giemsa e microscopia ottica. Dopo la semina, collocare le celle di una umidificata al 5% CO 2 incubatore a 37 ° C. Sostituire media ogni 3 giorni aspirando delicatamente la metà dimedio e aggiungere lo stesso volume di terreno RPMI-1640 fresco supplementato con 10% FCS HI-. utilizzo Soluzioni per LPS liberi e composti e bassi livelli di LPS in HI-FCS (0,05 ng / ml o meno). NOTA: Una leggera variazione media è di importanza fondamentale in quanto il Gφ, che si sviluppano nella cultura non saldamente allegare al piatto cultura e il lavaggio vigoroso può anche lavare le cellule in via di sviluppo. La comparsa di Gφ è evidente a 3 – 4 giorni dopo PMN coltura, a seconda del donatore di sangue. La maggior parte delle analisi e dei test qui descritti vengono eseguiti tra 6 – 7 giorni in coltura, quando Gφ sono di dimensioni molto grandi. Va notato che l'aggiunta di 1 – 10 LPS ng / ml in mezzo RPMI-1640 non ha influenzato sviluppo Gφ in coltura. 14 2. Microscopia confocale a scansione laser Preparare cytospins 16 dai neutrofili isolati a fresco, e dal 7 al giorno sviluppato culture Gφ(Preparato nella sezione 1). NOTA: per aumentare la concentrazione di Gφ nel piatto per varie analisi, rimuovere delicatamente la metà del mezzo. Assicurarsi che Gφ non vengono rilevati nel medio rimosso esaminando il mezzo sotto un microscopio ottico. Poi, intensamente pipettare il medium rimanente per rimuovere leggermente aderito Gφ. Centrifugare la media per 10 minuti a 200 xg, e risospendere il pellet in 100 – 120 ml di media. Utilizzare 100 – 120 ml di mezzo contenente cellule per ogni diapositiva. Preparare vetrini doppio o triplo, da ogni trattamento. Spin per 7 min a 84 x g. Essiccare le cellule filate e fissare le cellule con 4% paraformaldeide a temperatura ambiente per 10 minuti sotto una cappa chimica. Lavare 3x con PBS (~ 100 microlitri per alcuni secondi per lavaggio). Per la colorazione intracellulare, permeabilize cellule con 0,5% Triton X-100 in PBS a temperatura ambiente per 10 minuti e lavare 5x con PBS. NOTA: In tutte le fasi, l'uso di adeguati buffer / volu soluzioneme per coprire il perimetro delle cellule sul vetrino. Utilizzare una penna barriera idrofoba per la determinazione delle cellule perimetro. Attenzione: Paraformaldeide è tossico. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Indossare dispositivi di protezione adeguati. cellule di blocco con 10% siero di capra normale in RPMI-1640 e incubare una notte a 4 ° C oa temperatura ambiente per 40 min. Lavare con PBS. Incubare con singolo anticorpo (Ab) o una combinazione di mouse e di coniglio anticorpi primari (ABS) ad una diluizione 1: 100 (~ 100 ml). Incubare per una notte (18 – 20 ore) a 4 ° C. NOTA: Qui, monoclonale di topo Abs incluso: anti-CD14, anti-CD63, anti-CD66b, anti-CD1c, CD15 anti-, e anti-citocromo b-245 catena leggera (p22- identificazione phox). Policlonale di coniglio Abs incluso: anti-CD68, anti-CD36, anti-LC3B, anti-mieloperossidasi, elastasi anti-neutrofili (NE), e anti-Nox2 / gp91- phox Abs. controlli isotipo IgG1 inclusi purificata mouse e IgG2, e IgG di coniglio. prepare le Abs secondo le istruzioni del produttore e l'uso appropriato di volume (circa 100 ml) per coprire il perimetro delle cellule. Lavare le cellule e incubare con 1/400 anticorpi secondari Cy2-CF (488A) coniugata capra anti-IgG di coniglio (verde) e / o Cy5 (CF 647) di capra coniugata anti-topo IgG (rosso) a temperatura ambiente per 40 min. NOTA: diluire e preparare Abs secondo le istruzioni del produttore. Dopo il lavaggio, montare diapositive con una goccia di mezzo di montaggio, contenente 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per la colorazione nucleare, poi subito a mettere il vetrino. Analizzare le diapositive da un sistema di scansione laser confocale utilizzando microscopio a fluorescenza e oggettiva olio di immersione Plan Apo 40X. Eseguire l'analisi in 30 minuti a 2 ore dopo la preparazione dei vetrini o conservare a 4 ° C durante la notte. Calcolare l'area delle cellule e l'intensità di fluorescenza utilizzando un software di imaging (ad esempio immagine J). Per la co-localizzazione, quantify dal software utilizzando Manders Overlap Coefficiente (MOC) 17. NOTA: solo le cellule con MOC> 0.6 può essere considerato come cellule con notevole co-localizzazione. 3. Trasmigrazione di PMN attraverso le cellule endoteliali: effetti di IL-8 sul gigante Fagocita (Gφ) Formazione NOTA: L'utilizzo di coltura cellulare 24 pozzetti permeabile inserti per il saggio trasmigrazione delle cellule. Coat camera superiore dell'inserto con 150 microlitri fibronectina ad una concentrazione di 50 ug / ml, e mantenere a temperatura ambiente per 30 min. Aggiungere alla camera superiore 5 x 10 4 EA.hy926 cellule endoteliali / bene, risospese in 150 ml di formulato Modified Media Dulbecco dell'Aquila (terreno di coltura completo). NOTA: Assicurarsi che il monostrato endoteliale è confluenti prima dell'uso. Per la camera inferiore, aggiungere 700 ml di mezzo di crescita completo. Posizionare il permeabilecoltura cellulare inserisce in vassoi a grappolo e la cultura delle cellule endoteliali EA.hy926 per 2 giorni a 37 ° C in 5% di CO 2. NOTA: In parallelo, il secondo giorno preparare PMN fresco (come descritto nella sezione 1). Dopo 2 giorni, sostituire il mezzo nelle camere inferiori e superiori degli inserti. Per la camera inferiore, aggiungere mezzo RPMI-1640 supplementato con 10% FCS e IH-interleuchina (IL) -8 ad una concentrazione finale di 50 nM / ml. Non aggiungere IL-8 per controllare camere inferiori. Per ogni camera superiore, aggiungere 10 6 fresca PMN in 100 ml di RPMI-1640 supplementato con 10% IH-FCS. Incubare le piastre a grappolo a 37 ° C in 5% CO 2 per 90 min. Dopo 90 min di incubazione, rimuovere le cellule dalla parte superiore e le camere inferiori separatamente e contare ogni sottopopolazione. cellule esprimono in ciascuna camera come percentuale delle cellule aggiunto totale. NOTA: Rimuovere con attenzione le cellule dalla chamb superioreer pipettando delicatamente per evitare di rimuovere le cellule endoteliali e trasferire in una provetta sterile. Rimuovere le cellule dalla camera inferiore pipettando e lavare la camera inferiore con 500 microlitri e trasferimento in un secondo tubo sterile. Pool 10 6 celle da diversi pozzi di trasmigrante (camera bassa) e non-migrazione (camera alta) frazioni PMN e cultura ciascuno per 7 giorni senza fattori di crescita, come specificato nei passaggi 14 – 16 (sezione 1). Spin le cellule su vetrini 16 e analizzare le cellule sviluppate in ogni condizione di cultura al microscopio confocale come descritto nella sezione 2.

Representative Results

Neutrofili Autophagocytosis e sviluppo in cultura Neutrofili autophagocytosis e il loro sviluppo in Gφ entro 7 giorni di cultura è mostrato nelle figure 3 e 4. In giorni 4 – 7, la loro dimensione è stata notevolmente ampliata, 15 e autophagosytosis era evidente fin da 90 min dopo la co-coltura dei neutrofili con macchie membrana fluorescenti (PKH-26, rosso; PKH-67, verde). 14 Come controllo di questo neutrofili sottopopolazione, alcune culture dei neutrofili sono stati trattati con GM-CSF / IL-4. Le cellule citochine trattate aumentati in dimensione all'interno 7 – 14 giorni in coltura come precedentemente descritto. 18, 19 Ma, erano più piccole di quelle Gφ e aveva proiezioni citoplasmatiche simile DC-like cellule (figura 5), come riportato in precedenza b y Oehler et al. 19 Inoltre, il GM-CSF / IL-4 cellule trattate sono risultati negativi o aveva una bassa espressione CD66b, 15 dimostrando chiaramente differenze morfologiche e potenzialmente funzionali pure. Figura 3: Autophagocytosis in via di sviluppo Giant fagociti (Gφ) in coltura. Appena isolati neutrofili purificati sono stati etichettati con PKH-67 (verde) o PKH-26 coloranti fluorescenti (rosso) a membrana a tempo zero, e poi co-coltura e seguiti fino a sette giorni. Le cellule sono state filate su vetrini, i nuclei sono stati colorati con DAPI e campioni sono stati analizzati al microscopio confocale. Autophagocytosis è già evidente dopo 90 min di co-coltura. La fusione di rosso e verde in giallo e arancione è chiaramente evidente in via di sviluppo Gφ.file / ftp_upload / 54826 / 54826fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4: Sviluppo di gigante fagociti (Gφ) in coltura. Appena isolati neutrofili purificati sono stati seguiti fino a 7 giorni in coltura. Le cellule sono state filate su vetrini ad intervalli di tempo indicati, colorate con maggio Grunewald-Giemsa, e analizzati con un microscopio a campo chiaro. Un individuo con pochi eosinofili è presentato per il confronto. Notare che la dimensione di eosinofili rimane invariata in coltura. olio di ingrandimento 100X. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5: confronto tra l'andamento del gigante fagociti (G φ) e GM-CSF / IL trattata neutrofili nella cultura. (A) maggio Grunwald-Giemsa neutrofili macchiati coltivati senza (Gφ) e con GM-CSF / IL-4 per 7 giorni. I campioni sono stati analizzati con un microscopio campo chiaro. Ingrandimento, X40. Le cellule sviluppate in culture con media integrato con GM-CSF / IL-4 mostrano diffuse proiezioni citoplasmatici, ma sono più piccoli Gφ. (B) neutrofili appena isolate sono stati etichettati con-26 PKH colorante (rosso) e coltivate in terreno privo di citochine per 7 giorni o etichettate con-67 PKH dye (verde) e coltivate in terreno supplementato con GM-CSF / IL-4 per 7 giorni. Poi, le cellule sono state sviluppate mescolati in un rapporto 1: 1 e co-coltura per 2 ore. Le cellule sono state fissate e analizzati da MICR confocaleoscopy. Questa cifra è stata modificata da riferimento. 15 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Per studiare ulteriormente il corso dello sviluppo Gφ, i loro cambiamenti morfologici sono stati seguiti da microscopia time-lapse. Video-1 (giorno 3 al giorno 4) e il video-2 (giorno 4 al giorno 5) dimostrano il loro sviluppo nelle culture dei neutrofili purificati. Questi sono Gφ non aderente o leggermente aderente con una capacità di movimento limitata e ingerire attivamente circostante resti dei neutrofili e detriti. In video 3, il movimento di derivate da monociti Mφ e Gφ viene confrontato in una coltura di monociti / neutrofili mista. Il Mφ striscia attivamente (a sinistra, cellule senza etichetta). Il Gφ (a destra), è luminoso PKH-26 cellule etichettati. Video-1: illustra lo sviluppo della Giant fagociti in colture purificate PMN nei giorni 3 – 4 da Time-lapse Microscopia. I neutrofili sono stati seguiti nella cultura dal giorno 3 al giorno 4 dal time-lapse sistema di microscopia time-lapse microscopy.The è composto da microscopio a fluorescenza motorizzato invertito, e una camera CCD B / N ad alta risoluzione, con una sul palco incubatore. Immagine acquisizione cattura di time-lapse è stata presa ogni 10 min. Originariamente pubblicato in riferimento 14 Clicca qui per visualizzare questo video. Video-2: dimostra lo sviluppo della Giant fagociti in purificata PMN cultura nei giorni 4-5 da Time-lapse Microscopia. I neutrofili sono stati seguiti nella cultura dal giorno 4 al giorno 5 al microscopio time-lapse. Il sistema di microscopia time-lapse è composto da microscopio a fluorescenza motorizzato invertito, e una camera CCD B / N ad alta risoluzione, con una sul palco incubatore. Immagine acquisizione cattura di time-lapse è stata presa ogni 10 min. Clicca qui per visualizzare questo video. Video-3: A Fagocita gigante e un macrofago sviluppato in co-coltura. Monociti / neutrofili co-coltura è stata seguita dal giorno 4 al giorno 5 al microscopio time-lapse. macrofagi derivate da monociti (a sinistra); luminoso (PKH-26 tinto cellule) fagocita gigante neutrofili-derivato (a destra). Il sistema di time-lapse microscopia per il video è composto da invertito MICR fluorescente motorizzatooscope, e una camera CCD B / N ad alta risoluzione, con una sul palco incubatore. Immagine acquisizione cattura di time-lapse è stata presa ogni 10 min. Originariamente pubblicato in riferimento 14 Clicca qui per visualizzare questo video. L'espressione di marcatori in fagociti giganti L'origine neutrofili di Gφ è stata verificata dalla positiva espressione dei seguenti marcatori neutrofili CD66b / CD63 / MPO / NE / CD15 (Figura 6). Il Gφ anche espresso NADPH ossidasi, i recettori scavenger oxLDL – CD68 e CD36, e conteneva vacuoli LC3B rivestite e aggregati (identificate da Western blotting come LC3BII 15), che dimostrano la presenza di un marcatore autofagia. Tuttavia, essi sono risultati negativi per lignaggio monocitica (CD14, CD16 e CD163) e Dendritcellule IC (CD1c e CD141) marcatori, suggerendo che Gφ non nasce da monociti contaminanti. Figura 6: espressione di vari marcatori per i neutrofili, monociti e cellule dendritiche a Giant fagociti (Gφ) dopo 7 giorni di coltura. espressione positiva del neutrofili specifico marcatore granuli CD66b, il azurophil granuli marker CD63 e MPO, neutrofili elastasi e CD15. espressione negativa per i marcatori CD1c e CD141 dendritiche e marcatori lignaggio monociti CD14, CD16 e CD163. Inoltre, Gφ espresso il marcatore LC3B autofagia, i recettori scavenger CD68 e CD36 e le subunità NADPH ossidasi subunità gp91-phox / P22-phox. I nuclei sono state colorate con DAPI, ed i campioni sono stati analizzati al microscopio confocale. Questa cifra è stata modificata da riferimenti. 14 , 15 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Funzioni di Gφ – NADPH ossidasi di attivazione, ROS Produzione e fagocitosi: Fagocitosi delle sfere di lattice e zymosan opsonizzati era evidente in Gφ. Gφ anche generato basale ROS (Figura 7A), e risponde alle zymosan e stimolazione PMA da burst ossidativo (Figura 7B-D). Tuttavia, a differenza di monociti o neutrofili, Gφ generato ROS anche in risposta alla stimolazione oxLDL ed erano macchiati da Oil Red O (Figura 7B, F). Di nota, il trattamento dei neutrofili freschi con l'inibitore della NADPH ossidasi – DPI, non solo ha inibito la produzione di ROS, ma anche pformazione Gφ revented nella cultura, suggerendo che i ROS segnalazione è essenziale per la formazione Gφ. 14, 15 Figura 7: burst ossidativo, fagocitosi, e oxLDL adozione da gigante fagociti (Gφ). Produzione (A) basale ROS è evidente nei lisosomi di Gφ. (B) la produzione di ROS in risposta alle LDL ossidate (oxLDL), PMA e zymosan (particelle zymosan sono chiaramente noti). (C) Nitroblue tetrazolium (NBT) prova Gφ che mostra l'attività burst respiratorio senza e con PMA (scivoli sono senza macchia, ma gli inserti sono colorate con May Grunwald-Giemsa). (D) test NBT e maggio Grunewald-Giemsa macchiati Gφ con PMA e PMA / DPI che ha inibito NADPH ossidasi e ROS. (E) fagocitosi di LATEX e zymosan IgG-opsonizzati in PKH-26 (rosso) cellule colorate. (F) Oil Red O colorazione in oxLDL non trattati e trattati Gφ. Questa cifra è stata modificata da riferimenti. 14, 15 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Trasmigrazione di PMN attraverso le cellule endoteliali Al fine di identificare potenziali neutrofili sub-popolazioni che potrebbero svilupparsi in Gφ, la migrazione dei neutrofili attraverso monostrati di cellule endoteliali è stata determinata (Figura 8A). Dopo 90 min, 62,3 ± 12,2% dei neutrofili trasmigrato attraverso le cellule endoteliali verso IL-8 nel vano inferiore. Da segnalare, Gφ positiva per CD66b / CD15 / LC3B sviluppata solo dalla popolazione trasmigrato dei neutrofili, mentre cellule che si sono sviluppate dalla frazione neutrofili non migrazione erano più piccole in termini di dimensioni e negativo per i marcatori neutrofili CD66b / CD15 (Figura 8B, 8C) . Figura 8: effetti di IL-8-dipendente PMN Trasmigrazione attraverso le cellule endoteliali sul gigante Fagocita Formazione (Gφ). (A) Uno schema che illustra saggio di trasmigrazione dei neutrofili attraverso monostrati di cellule endoteliali (ECS) in direzione di IL-8. Questo test può essere considerato come un modello per neutrofili reclutamento siti infiammatori acuti. (B – C) Nel saggio la migrazione delle cellule (indicati nel protocollo 3), trasmigrando (B) e non-migrazione (C) neutrofili fracle sono stati coltivati per sette giorni senza fattori di crescita (come nel protocollo 1). Poi, le cellule sono state filate su vetrini e analizzate mediante microscopia confocale. Le cellule fissate sono state colorate per CD66b (rosso), LC3B (verde) e CD15 (rosso). I nuclei sono state colorate con DAPI (blu). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

fagociti giganti (Gφ) sono una sottopopolazione di nuova definizione di cellule neutrofili-derivati che esprimono i marcatori neutrofili fondamentali e specifiche come CD66b / CD15 / CD63 / MPO / NE. Questo tipo di phagocyte neutrofili derivato non è stato descritto in letteratura prima. A differenza di neutrofili che sono di breve durata e vanno incontro ad apoptosi, Gφ sono Annessina-V-negativo e visualizzare la durata della vita estesa. Eppure, come i neutrofili, Gφ anche interiorizzare particelle e produrre NADPH ossidasi-dipendente ROS in risposta a quelle particelle e di PMA. Tuttavia, la loro capacità di interiorizzare OxLDL e di conseguenza per la produzione di ROS sono caratteristiche uniche di Gφ. ¹⁴

Una serie di fattori hanno mostrato di influenzare il loro sviluppo in coltura. La mancanza di citochine esterni o fattori di crescita nel terreno di crescita è essenziale (in particolare GM-CSF / IL-4). Tuttavia, i neutrofili migrazione verso IL-8 si è rivelata un fattore discriminante tra coloro che devfuggì in Gφ e quelli che non ha fatto. Inoltre, internalizzazione di detriti derivanti dai neutrofili apoptotici, l'espressione di proteine autofagia (LC3B) e NADPH ossidasi funzionali, sono stati tutti dimostrato essere essenziale per il loro sviluppo, dal loro inibizione impedito formazione Gφ (Figura 1). Apparentemente, lo sviluppo di queste cellule giganti derivanti dai neutrofili differisce da quella che caratterizza la formazione di cellule giganti in monociti / macrofagi lineage. La forma multi-nucleate cellule giganti ultimi associati a diverse malattie infiammatorie croniche, ^{^20,} ^21, mentre il neutrofili Gφ qui descritto si sviluppano via autophagocytosis, inglobando i resti cellulari e restano per lo più mono-nucleate in tutto il loro sviluppo, ¹⁴ (raramente tuttavia, a volte un secondo nucleo può osservare). Inoltre, una serie di controlli stabilito la loro origine neutrofila: (1) espresfissione dei marcatori neutropilic specifici e l'assenza di marcatori dendritiche e lignaggio monocitica, (2) il loro sviluppo ostacolato in monociti / PMN co-culture, (3) i loro diversi modelli di movimento nella cultura da macrofagi (come evidenziato dal imaging cellulare dal vivo e il tempo microscopia -lapse), ¹⁴ (4) la loro adesione alla luce di piatti di plastica e (5) il loro sviluppo da pura CD15 ⁺ / CD14 ^– PMN acquisiti mediante citometria di flusso.

Alcune delle funzioni individuate in vitro potrebbero darci indizi per loro potenziali funzioni in vivo. Per esempio, le capacità di Gφ di consumare grandi quantità di granuli dei neutrofili e detriti, la presenza di grandi vacuoli, e il LC3B espressione – una proteina autofagia che contribuisce a diminuire l'infiammazione attraverso le interazioni normativi con vie di segnalazione immunitarie innate, ²² – che abilità supporto scavenging. Come tale, Questi risultati indicano anche che Gφ potrebbe non funzionare in siti infiammatori in cui il sistema Mφ / DC è insufficiente o sopraffatti, e contribuiscono così alla risoluzione dell'infiammazione. Questo concetto potrebbe essere supportata dal fatto che nelle culture dei monociti / neutrofili misti è ostacolato lo sviluppo Gφ. ¹⁴ Inoltre, dato che Gφ esprimono recettori oxLDL scavenger (CD36, CD68), interiorizzare oxLDL, e produrre ROS in risposta ad essa, potrebbe indicare che sono coinvolti nei processi aterosclerotici per risolvere l'infiammazione. Dal momento che Gφ sviluppata solo da neutrofili che migrarono verso IL-8, e la trasmigrazione neutrofili 'attraverso monostrati endoteliali verso IL-8 rappresenta neutrofili reclutamento ai siti infiammatori acuti, questo risultato può anche supportare le funzioni di anti-infiammatori. Viceversa, le prestazioni di Gφ in determinate condizioni infiammatorie potrebbe consentire loro di assumere costituenti dei granuli e ROS, pertanto, contribuendo acoerente infiammazione e danni ai tessuti. ²⁰ Tuttavia, nel complesso, le loro capacità autofagici indicano che Gφ sono probabilmente coinvolti nel diminuire la risposta infiammatoria, piuttosto che perpetuare esso.

È interessante notare che abbiamo recentemente identificato la presenza di Gφ in placche aterosclerotiche umane. (in preparazione). Tuttavia, un gran numero di questioni devono ancora essere svelati. Per esempio, sono Gφ pro- o anti-infiammatori? Quali sono i fattori che determinano la loro formazione e la funzione in vitro o in vivo? Quale specifica dei neutrofili sottopopolazione è la loro cellula precursore che facilita il loro sviluppo in Gφ? Sono associati con alcune patologie e quali? Collettivamente, ponendo domande interessanti per quanto riguarda la loro origine e le funzioni potenziali.

Tuttavia passaggi critici e le insidie all'interno del protocollo dovrebbero essere tenuti in mente. Un passo fondamentale nello sviluppo della Gφ is coltura neutrofili puri in mezzo privo di citochine, fattori di crescita o antibiotici. Un altro passo importante è quello di escludere che Gφ si sviluppano da monociti contaminanti e per accertare l'origine neutrofili di Gφ. Così, dopo la separazione del sangue dal gradiente discontinuo, i neutrofili sono stati ulteriormente sottoposti ad un ulteriore passaggio di purificazione mediante citometria di flusso utilizzando granulociti gating e CD15 ⁺ / CD14 ^– marcatori. Il Gφ sviluppato ottenuto da neutrofili che sono stati ulteriormente purificato mediante citometria di flusso separazione non differiva da quelli che non sono stati sottoposti a questo passaggio di purificazione. Pertanto, la maggior parte degli esperimenti sono stati condotti senza la citometria a flusso step di purificazione a causa di perdita di cellule aggiuntivo. Da segnalare, in alcuni rari casi alcuni eosinofili sono stati notati nella cultura. La loro dimensione è rimasta immutata durante il periodo di coltura. Dobbiamo anche notare che anche se ci sono un certo numero di metodiper la separazione dei neutrofili dal sangue umano, il metodo descritto qui è l'unico metodo che abbiamo impiegato e quindi non siamo in grado di confrontare lo sviluppo Gφ con altri metodi disponibili per la separazione dei neutrofili.

Un importante trabocchetto nelle indagini Gφ deriva dalla impossibilità di ottenere un numero sufficiente di popolazione pura Gφ adatto per vari saggi biochimici. E 'praticamente impossibile nelle condizioni sono stati condotti i nostri esperimenti. In primo luogo, la resa di Gφ è basso. Da 1,0 x 10 ⁶ PMN seminato circa 100 – 200 Gφ sviluppare dopo sette giorni in coltura, a seconda del donatore di sangue. In secondo luogo, è sostanzialmente difficile in questo momento per separare il sviluppata Gφ nella cultura dalla restante detriti neutrofili nel piatto. Queste limitazioni reso praticamente impossibile analizzare le cellule con metodi biochimici o biologia molecolare. Pertanto, questo protocollo è incentrato a descrivere l'identificazione e la funzione Gφ utilizzando la lucee microscopia confocale. La loro trasformazione morfologica dai neutrofili in Gφ nella cultura è stata seguita anche da imaging cellulare dal vivo e la microscopia lasso di tempo. ¹⁴ A quanto pare, i volumi di sangue molto più grandi possono essere necessari al fine di attuare metodi di biologia molecolare o biochimici e superare la bassa resa ottenuta e che separa la praticabile Gφ dai detriti neutrofili 'nel piatto.

In sintesi, abbiamo recentemente descritto per la prima volta lo sviluppo della Gφ nella cultura, una sottopopolazione di fagociti longevi di origine neutrofila. Pertanto, questo è l'unico metodo attualmente disponibili per ottenere Gφ in coltura, anche se i due principali limitazioni sopra menzionate devono essere superati (la bassa resa del Gφ ottenuta in coltura e l'incapacità di separare il Gφ sviluppato dai detriti neutrofili nella cultura piatto). Eppure, la loro preparazione e l'identificazione, presentato in questo protocollo, è Essential per gli scienziati interessati a risposte infiammatorie e della biologia dei neutrofili e plasticità, al fine di indagare ulteriormente il potenziale significato e le funzioni di Gφ.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano il Dr. Edith Suss-Toby per il suo prezioso aiuto con gli studi di microscopia confocale. Questo studio è stato sostenuto dal Ministero per l'Immigrazione assorbimento e il Comitato per la Pianificazione e Budgeting del Consiglio per l'istruzione superiore nel quadro del programma Kamea (LD e AP). Abbiamo inoltre riconosciamo con gratitudine il sostegno del Research Fellow dalla signora Davis Fondazione Post-Doctoral Research Fellowship (OR).

Materials

Sterile scalp vein set (21GX3/4)	Bio Diagnostics Ltd.	# 20080312	A strile needle for venipancture
VACUETTE HOLDEX Single-Use Holder PP	Greiner Bio-One	# 450263	For securing during venipuncture
VACUETTE Tube K3E K3EDTA (16×100/9 ml)	Greiner Bio-One	# 455036	Sterile tube for blood collection
Nunclon MultiDish (24 wellx1ml)	Thermo Scientific	# 142475
Polypropylene conical centrifuge tube (50 ml)	Greiner Bio-One	# E14103PJ
Transwell-24 well (transmigration assay)	Corning	# CA-3415	Polycarbonate membrane, 6.5 mm diameter, 3 μm pores)
RPMI-1640 medium	BioIndustries	# 01-100-1A	Do not add antibiotics
EA.hy926 (ATCC CRL2922)	BioIndustries	# CRL-2922
ATCC-formulated Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	BioIndustries	# 302002	complete growth medium
Polysucrose – Histopaque1119	Sigma-Aldrich	# 1119-1	Tissue culture grade
Polysucrose – Histopaque1077	Sigma-Aldrich	# 1077-1	Tissue culture grade
Phosphate buffered saline (PBS) – ion free	BioIndustries	# 02-023-1A	Cell biology and molecular biology grade
Heat inactivated Fetal calf serum (HI-FCS)	BioIndustries	# 04-121-1B	Cell biology grade or tissue culture grade, low LPS
NaCl	Sigma	# S3014	Molecular biology grade, suitable for cell culture
Paraformaldehyde, 16%	Electron Microscopy Sciences	# 15710	Cell bology grade or tissue culture grade (only 16% PFA)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	# 9002-93-1	Molecular biology grade
Normal Goat Serum	BioIndustries	# 04-009-1	Cell biology and molecular biology grade
Trypan blue	BioIndustries	# 031021B	Tissue culture grade
May-Grünwald	Sigma-Aldrich	# MG500	Cell biology grade-(procedure No GS-10)
Giemsa stain Kit	Sigma	# 48900	Cell biololgy grade-(procedure No GS-10)
Fibronectin	BioIndustries	# 03090105
Human Interleukin-8 (CXCL8)	PeproTech	# 200-08-5
Anti-CD14 (clone 5A3B11B5)	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-58951	Mouse IgG2b; expressed by monocytes
Anti-CD63 (clone MX-49.129.5)	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-5275	Mouse IgG1; expressed by neutrophils
Anti-CD66b (clone 80H3)	AbD Serotec	# MCA216	Mouse IgG1; expressed by neutrophils
Anti-CD1c (BDCA-1) (clone AD5-8E7)	MACS Miltenyi Biotec	# 130-090-695	Mouse IgG2a; expressed by dendritic cells
Anti-CD15 (clone MY-1)	Abcam	# ab754	Mouse IgM; expressed by neutrophils
Anti-Cytochrome b-245 Light Chain (p22-phox) (clone 44.1)	BioLegend	# 650001	Mouse IgG2a; to recognize neutrophil NADPH oxidase complex
Anti-CD68	Protein Tech	# 16192-1-AP	Rabbit IgG; to recognize oxLDL scavenger receptor
Anti-LC3B	Sigma	# L7543	Rabbit IgG
Anti-Myeloperoxidase	Abcam	# ab45977	Rabbit IgG
Anti-Neutrophil elastase	Calbiochem	# 481001	Rabbit IgG
Anti-NOX2 (gp91-phox)	Abcam	# ab131083	Rabbit IgG
Anti-CD36 (SR-B3)	Novus Biologicals	# NB400-144	Rabbit IgG
Purified Mouse IgG1, κ Isotype Control (clone MG1-45)	BioLegend	# 401401	Antibody used as isotype control
Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control (clone MOPC-173)	BioLegend	# 400263	Antibody used as isotype control
Normal rabbit IgG	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-2027	Antibody used as isotype control
CF488A Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Biotium	# 20012	Anti-Rabbit IgG with the green fluorescent dye CF488A
CF647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Biotium	# 20043	Anti-Rabbit IgG with the red fluorescent dye CF647
CF488A Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Biotium	# 20010	Anti-Mouse IgG with the green fluorescent dye CF488A
CF647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Biotium	# 20040	Anti-Mouse IgG with the red fluorescent dye CF647
Fluorescent Mounting Medium with DAPI	Vectashield H-1000; Vector Lab Inc.	# E19-18	Nuclear staining
Confocal laser scanning microscope (LSM 700)	Carl Zeiss	Ser.# 3523000380	Plan Apo x40 immersion oil objective
Zeiss CLSM software (ZEN 2010)	Carl Zeiss MicroImaging GmbH	version 6.0	For colocalization analysis
ImageJ software	Wayne Rasband, NIH, USA	version 1.49k	For determination of cell areas and fluorescence intensity
Light microscope (Axiovert 25)	Carl Zeiss	Ser.# 201060153	Examination of cells in culture
Centrifuge (Megafuge 1.0 R)	Heraeus Instruments	# D-37520	Cells separation from blood; cytospins preparation
Inverted fluorescent microscope (Zeiss Axio Observer Z.1)	Carl Zeiss	Ser.# 3834001470	Demonstration of giant phagocytes development
Temperature-controlled incubation system (Cube&Box)	Life Imaging Services		Temperature control system for microscopes
High resolution digital CCD camera (AxioCam HRm)	Carl Zeiss	Ser.# 117090279	For capturing high-contrast image data from an examined cell objects

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Cite This Article

Lavie, L., Dyugovskaya, L., Polyakov, A., Rogovoy, O., Leder, E. Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro. J. Vis. Exp. (119), e54826, doi:10.3791/54826 (2017).