Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Lena Lavie; Larissa Dyugovskaya; Andrey Polyakov; Oksana Rogovoy; Eva Leder

doi:10.3791/54826

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

免疫与感染

Ontwikkeling en Identificatie van een nieuw subpopulatie van Human neutrofielen afgeleide Giant Fagocyten In Vitro</em

Published: January 25, 2017

doi:

10.3791/54826

Lena Lavie¹, Larissa Dyugovskaya¹, Andrey Polyakov¹, Oksana Rogovoy¹, Eva Leder¹

¹The Lloyd Rigler Sleep Apnea Research Laboratory, Unit of Anatomy and Cell Biology, The Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine,Technion-Israel Insitute of Technology

Summary

We beschrijven hier een werkwijze voor het verkrijgen en identificeren van een nieuw kenmerk subpopulatie van neutrofielen afgeleide reus fagocyten. Deze cellen ontwikkelen in de cultuur van verse menselijk bloed neutrofielen, en worden gekenmerkt door fagocytose, autofagie, immens groot formaat, en verlengde levensduur. Deze methode is van essentieel belang om verder te onderzoeken deze unieke neutrofielen afgeleid subpopulatie.

Abstract

Neutrofielen (PMN) zijn het best bekend om hun fagocytische functies tegen binnendringende pathogenen en micro-organismen. Ze hebben de kortste halfwaardetijd tussen leukocyten en in de niet-geactiveerde toestand zijn constitutief toegewijd aan apoptose. Wanneer aangeworven om inflammatoire sites om de ontsteking op te lossen, ze produceren een reeks van cytotoxische moleculen met krachtige antimicrobiële doden. Maar als deze krachtige cytotoxische moleculen vrij ongecontroleerd kunnen beschadigen omliggende weefsels. De laatste jaren echter neutrofiele veelzijdigheid steeds aangetoond door aan te tonen plasticiteit en immuunregulerende functies. We hebben onlangs een nieuw geïdentificeerd neutrofielen afgeleide subpopulatie, die spontaan ontwikkelt in standaard kweekomstandigheden zonder toevoeging van cytokinen / groeifactoren zoals granulocyt-koloniestimulerende factor (GM-CSF) / interleukine (IL) -4. Hun fagocytische capaciteiten van neutrofielen resten grotendeels bijdragen aan hun te verhogensize enorm; Daarom werden ze genoemd reus fagocyten (Gφ). In tegenstelling tot de neutrofielen, worden Gφ lang geleefd in de cultuur. Ze drukken het cluster van differentiatie (CD) neutrofielen markers CD66b / CD63 / CD15 / CD 11 b / myeloperoxidase (MPO) / neutrofielelastase (NE), en zijn verstoken van de monocytische lineage markers CD14 / CD16 / CD163 en de dendritische cd1c / CD141 markers . Ze take-up ook latex en zymosan, en reageren door oxidatieve uitbarsting op stimulatie met opsonized-zymosan en PMA. Gφ ook drukken de scavenger receptoren CD68 / CD36, en in tegenstelling tot neutrofielen, internaliseren geoxideerde-low density lipoproteïne (oxLDL). Bovendien, in tegenstelling tot vers neutrofielen of monocyten gekweekt, ze reageren op oxLDL verhoogde opname door reactieve zuurstof species (ROS) productie. Bovendien zijn deze fagocyten bevatten microtubule-geassocieerde eiwit-1 lichte keten 3B (LC3B) gecoat vacuolen, met vermelding van de activatie van autofagie. Met specifieke remmers blijkt dat zowel fagocytose en autofagie zijn prerequisites voor hun ontwikkeling en waarschijnlijke NADPH oxidase afhankelijk ROS. We beschrijven hier een werkwijze voor de bereiding van deze nieuwe subpopulatie van langlevende, neutrofielen afgeleide fagocytische cellen in kweek, de identificatie en de bekende eigenschappen. Dit protocol is essentieel voor het verkrijgen en karakteriseren Gφ om verdere onderzoeken hun betekenis en functie.

Introduction

Polymorfonucleaire neutrofielen (PMN) vormen de grootste populatie van leukocyten in het bloed, die als de eerste lijn van verdediging tegen binnendringende ziekteverwekkers door het produceren van een breed scala van cytotoxische moleculen. De traditionele opvatting is al lange tijd dat het bloed circuleert, van korte duur, professionele fagocyten, waarvan de eerste om te komen tot acute ontstekingen plaatsen voor infecties en hulp te bestrijden in de klaring van pathogenen en schadelijke deeltjes. ¹ In hun niet-geactiveerde toestand, neutrofielen zijn constitutief inzetten voor apoptose. Bij het migreren van het bloed naar ontstekingsplaatsen, neutrofielen ondergaan activatie ontsteking lossen. Ze fagocyteren en doden binnendringende micro-organismen, door het produceren van een reeks van cytotoxische moleculen als reactive oxygen species (ROS), lytische enzymen zoals neutrofiel elastase (NE) en cathepsine met krachtige microbicide activiteit. Om de val ziekteverwekkers, neutrofielen laat ook extracellulaire vallen (NET) Die bestaan uit draden met nucleaire chromatine antibacteriële peptiden en diverse lytische enzymen. Echter, ongecontroleerd vrijkomen van deze cytotoxische moleculen uit neutrofielen ook bestendigen ontstekingsreacties veroorzaken en schade aan de omliggende weefsels. ² Daarom is een effectieve klaring van apoptotische neutrofielen door macrofagen (MO) en dendritische cellen (DC) cruciaal is voor ontsteking lossen. ^{^3,} ^{^4,} ^{^5,} ⁶

In de afgelopen jaren echter, is het steeds duidelijk dat neutrofielen zijn zeer veelzijdig cellen, waarvan de functies gaan veel verder dan fagocytose en ziekteverwekker doden geworden. ^{^6,} ⁷ Door priming of activering ondergaan wordt neutrofielen plasticiteit geleidelijk aan steeds meer aandacht. Bijvoorbeeld bacteriën en mycobacteriën uitgedaagd neutrofielen kregenscheiden interleukine (IL) -10 en controle van de ontstekingsreactie, suggereert de aanwezigheid van immuno-regulerende responsen. ⁸ Post-mitotische neutrofielen werden naar trans-differentiëren tot MC-achtige cellen of DC-achtige cellen door digestie en presenteren van antigen fragmenten worden behandeld met cytokines en groeifactoren, ^{^9,} ¹⁰ gedrang komen, een cruciale rol bij het integreren aangeboren en adaptieve reacties. ^{^3,} ⁶ Activering door groeifactoren gestimuleerd engulfment apoptotische neutrofielen of celresten daardoor vergemakkelijkt klaring van vuil op ontstoken plaatsen en de resolutie van ontsteking, ^{^3,} ⁹ bijzonder wanneer de MC / DC inklaringssysteem ontoereikend of overweldigd, ^{^11,} ¹² suggereren potentiële 'zelfregulering' to re helpenoplossen van de ontstekingsreactie. Dit, omdat apoptose is een vorm van gereguleerde eigen dood die het extracellulaire vrijkomen van cytotoxische verbindingen kunnen remmen en aldus voorkomen dat de omringende weefsels. ⁶

Langdurige overleving is een ander kenmerk van neutrofiel activatie en werd gedemonstreerd door behandeling met verschillende gastheer afgeleide factoren, zoals granulocyt-koloniestimulerende factor (G-CSF), granulocyt-macrofaag-koloniestimulerende factor (GM-CSF), inflammatoire cytokines zoals interferon ( IFN) -γ, tumornecrosefactor (TNF) -α en / of pathogeen afgeleide producten, dus, waardoor neutrofielen om hun overleving te moduleren. ⁶ In feite, neutrofielen overleving is een voorwaarde voor de plasticiteit en is geassocieerd met het vermogen tot fagocytose voeren. ^{^6,} ¹³ Hieruit bleek ook koppelen aan fenotypische en functionele veranderingen die afhankeDED op genexpressie opgereguleerd door het induceren van de synthese van nieuwe eiwitten die betrokken zijn neutrofielen levensduurverlenging en verminderde apoptose. ¹⁰

Unlike neutrofielen die kortstondig zijn en constitutief apoptose ondergaan in kweek, of de cytokinen / groeifactoren geactiveerde neutrofielen, hierboven beschreven, welke levensduur uitbreiden, hebben we recent geïdentificeerde nieuwe, kleine subpopulatie van neutrofielen die spontaan ontwikkelt in langdurige standaardkweek voorwaarden van vers geïsoleerde menselijk bloed neutrofielen zonder extern toevoeging van cytokinen of groeifactoren. ¹⁴ Deze-neutrofielen afgeleide cellen, die nog niet eerder in de literatuur beschreven werden genoemd reus fagocyten (Gφ). De Gφ hebben uitgebreid levensduur in cultuur, zijn ze volledig ontwikkeld binnen 5-7 dagen, en worden gekenmerkt door een unieke morfologische kenmerken, fenotypische expressie en functies. Ze zijn enorm vergroot als gevolg van autophagocytosis van dode neutrofielen resten, gevacuoliseerd en bevatten phagolysosomes. De Gφ drukken de specifieke neutrofielen korrels marker – cluster van differentiatie (CD) 66b, de azurofiele korrels markers – CD63 en myeloperoxidase (MPO) en aanvullende neutrofielen merkers zoals CD11b, NE, CD15, de NADPH oxidase subeenheden gp91- phOx en p22- phOx, en de autofagie marker -LC3BII. ^{^14,} ¹⁵ Functioneel zij actief benutting latex korrels en zymosan deeltjes, en het genereren ROS reactie op zymosan en forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) stimulatie. Interessant is dat, in tegenstelling tot vers neutrofielen, Gφ ook intensief drukken de scavenger receptoren CD68 en CD36, take-up geoxideerde low density lipoproteïne (oxLDL), en het genereren van ROS in reactie op stimulatie met oxLDL. Bovendien Gφ ontberen de monocytische afkomst markers CD14, CD16 en CD163 of dendritische markers cd1c en CD141. Bovendien phagocytosis en autofagie en waarschijnlijk functioneel NADPH oxidase voorwaarden zijn voor hun ontwikkeling. Dit omdat de fagocytose-remmer cytochalsin B, de autofagie inhibitoren 3-methyladenine (3-MA) en bafilomycine (BafA1) en NADPH oxidase inhibitor – difenyleen jodonium (DPI) – verhinderde de ontwikkeling. Bovendien, monocyten / neutrofielen co-culturen, evenals de blootstelling aan intermitterende hypoxie belemmerd hun ontwikkeling, terwijl neutrofielen aanpassing aan de aanhoudende hypoxie was duidelijk. ^14,15 De voorgestelde ontwikkeling in kweek wordt in figuur 1 .De protocol in het onderhavige document beschreven stap voor stap de bereiding van Gφ van vers geïsoleerde menselijk bloed circulerende neutrofielen, de ontwikkeling, de identificatie en enkele basiskenmerken. Dit protocol kan worden gebruikt om verder te onderzoeken en onthullen het brede spectrum en de rol van deze nieuw beschreven en intrigerende neutrofielen afgeleide Gφ om characterize hun betekenis en hun mogelijke functies.

Figuur 1: Schematische weergave van Giant Cells Development in 7 Day neutrofielen Cultures. Er wordt gesuggereerd dat bij inflammatoire sites (1) neutrofielen ondergaan apoptotische celdood, en (2) afgiftemembraan-omringde fragmenten die nucleaire afval, korrels (groene en rode stippen) en andere subcellulaire bestanddelen die autofagie mechanismen activeren. (3) Giant fagocyten (Gφ) te ontwikkelen op lange termijn neutrofielen culturen verstoken van cytokines en groeifactoren door het internaliseren van apoptotische lichamen en neutrofielen puin, met behoud van de functionele NADPH oxidase.They worden gekenmerkt door diverse neutrofiele CD66b + / CD63 + / MPO + / CD15 + / CD11b + / NE markers, grote phagosomes omsluit korrels en celresten, en scavenger receptoren CD36 en CD68. Gb1; meestal mononucleaire cellen kunnen internaliseren ook diverse deeltjes geoxideerd LDL en het genereren van ROS. De membranen van de vacuolen te vullen Gφ bevatten LC3B (aangegeven in donkerblauw), een marker van autophagosomal membraan, hetgeen duidt op een strikte associatie tussen autofagie en gigantische formatie fagocytensysteem. Gφ niet ontwikkelen in medium met GM-CSF / IL-4. Ook remmers zoals de NADPH oxidase inhibitor – difenyleendicarbonzuur jodonium (DPI), de autofagie inhibitoren 3-methyladenine (3-MA) en bafilomycine (BafA1) en de fagocytose remmer cytochalasine B (. Cyto B) af te schaffen hun vorming. (4) Potentiële Gφ functies in vivo kunnen anti- of pro-inflammatoire eigenschappen en deelname aan atherosclerotische processen (dit cijfer is gebaseerd op onze bevindingen ^{^14,} ¹⁵ en werd gewijzigd ten opzichte van het begeleidend redactioneel door BErton ^20). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Het protocol werd op basis van de verklaring van Helsinki is goedgekeurd door de lokale Comité voor de Rechten van de Mens en alle deelnemers een informed consent formulier ondertekend. 1. neutrofielen Isolatie en Ontwikkeling van Gφ in Cultuur LET OP: Alle stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van steriele kwaliteit lipopolysaccharide (LPS) -vrij oplossingen in een Bio-Safety laminaire stroming kap. Niet antibiotica, cytokines en groeifactoren toe te voegen aan het Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medium. Het verkrijgen van ten minste 40 ml veneuze bloed van jonge gezonde volwassenen met een steriele hoofdhuid ader set. Trekken bloed in vacutainer buisjes die ethyleendiamine tetra azijnzuur K 3 zout (K 3 EDTA) en meng voorzichtig. Houd het bloed bij kamertemperatuur. Isoleer de neutrofielen door tweestaps discontinue dichtheidsgradiënt via polysucrose bij 1,119 en 1,077 g / ml. Breng oplossingen op kamertemperatuur voor gebruik. LET OP: Tijdens het centrifugeren, rode bloedcellencellen (RBC) worden geaggregeerd door de polysucrose en sediment snel. De mononucleaire cellen (monocyten / lymfocyten) worden gevonden tussen de bovenste plasma / polysucrose -1077-interface, terwijl de neutrofielen net boven de RBC's worden gevonden in de polysucrose -1077 / 1119 interface (zie figuur 2). Deze werkwijze maakt gelijktijdige scheiding van mononucleaire cellen en neutrofielen van hetzelfde individu. Figuur 2: neutrofielen Isolatie van humaan volbloed. Polysucrose op 1,077 g / ml wordt zorgvuldig gelaagd bovenop polysucrose-1,119 g / ml een discontinue gradiënt te vormen. Het verdunde bloed wordt dan gelaagd bovenop de polysucrose-1,077. De buizen worden onmiddellijk gecentrifugeerd bij 700 g gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder rem. Drie verschillende bands worden genoteerd. (A) Mononucleaire cellen, (B) polymorfonucleaire cellen (PMN),en (C) rode bloedcellen (RBC) aan de onderzijde van de buis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Voeg 12 ml polysucrose-1119 op de bodem van een 50 ml steriele polypropyleen conische centrifugebuis. laag zorgvuldig 12 ml polysucrose-1077 op de polysucrose -1119. Verdun 10-12 ml bloed tot een eindvolume van 24 ml bloed met ionvrij fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 2% door hitte geïnactiveerd foetaal kalfsserum (HI-FCS). laag voorzichtig 24 ml van het verdunde bloed op de bovenste helling van de buis. Centrifugeer bij 700 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur (20-24 ° C) zonder rem. LET OP: centrifugeren bij lagere temperaturen kan resulteren in cel klonteren en slechte herstel. Verwijder de buizen voorzichtig uit de centrifuge without storen het verloop. Twee opake lagen worden waargenomen (A: Mononucleaire cellen en B: PMN, weergegeven in figuur 2). Zuig en gooi de vloeistof tot 0,5 cm boven laag A. Transfer (of discard) de cellen van deze laag op een buis met de vermelding "Mononucleaire". Aspireren en gooi de resterende vloeistof tot 0,5 cm boven laag B. Breng de cellen van deze laag tot een buis gemerkt "PMN". Pool PMN van elk twee gradiëntbuizen en wassen met PBS dat 2% HI-FCS tot een eindvolume van 30 ml. Centrifugeren gedurende 12 min bij 200 xg, verwijder het supernatant af en gooi. Om zich te ontdoen van verontreinigende rode bloedcellen (RBC), voeg 3 ml van hypotone 0,2% ijskoud steriel NaCl terwijl resuspenderen de pellet door voorzichtig tekening in en uit met een 1 ml steriele pipet tip. Blijf op ijs gedurende 30 sec. Na 30 s, isotoniciteit hersteld door toevoeging van 3 ml steriele 1,6% NaCl ijskoud aan de buis. De 6 ml isotonische zoutoplossing, voeg 6 ml voorverwarmde (37 ° C) RPMI-1640 medium aangevuld met 2% HI-FCS en centrifugeer bij 250 xg gedurende 12 min. Verwijder het supernatant. De PMN pellet moet schoon van RBC vervuiling. NB: Als besmet door RBC, de PMN pellet verschijnt roodachtig. Als sommige verontreinigende RBC blijven Herhaal stap 9 en 10 keer meer. Resuspendeer de celpellet in 4 ml RPMI-1640 aangevuld met 10% HI-FCS en tel de cellen hun concentratie en levensvatbaarheid te bepalen door trypan blauw exclusie. Stel de concentratie 1,25-1,5 x 10 6 PMN / ml (afhankelijk van de experimentele behoeften), en plaat 1,0 ml / putje in een 24 wells plaat. LET OP: De zuiverheid van neutrofielen in de granulocyten populatie overschreden altijd 95%, zoals vastgesteld door May Grunewald-Giemsa kleuring en lichtmicroscopie. Na het zaaien, zet de cellen in een bevochtigde 5% CO2 incubator bij 37 ° C. Vervang medium om de 3 dagen door voorzichtig opzuigen helft vanhet medium en hetzelfde volume vers RPMI-1640 medium aangevuld met 10% HI-FCS voegen. Met LPS vrije oplossingen en samenstellingen en lage niveaus LPS in HI-FCS (0,05 ng / ml of minder). LET OP: Een zachte medium verandering is noodzakelijk omdat de Gφ, die zich ontwikkelen in de cultuur niet goed hechten aan de cultuur schotel en krachtig wassen kan ook wassen de zich ontwikkelende cellen. Het uiterlijk van Gφ merkbaar bij 3-4 dagen na PMN kweken, afhankelijk van de bloeddonor. De meeste analyses en testen beschreven uitgevoerd tussen 6-7 dagen kweken bij Gφ zijn erg groot. Opgemerkt wordt dat toevoeging van 1-10 ng / ml LPS aan de RPMI-1640 medium had geen effect Gφ ontwikkeling in kweek. 14 2. confocale laser scanning microscopie Bereid cytospins 16 van vers geïsoleerde neutrofielen en de 7 dagen ontwikkeld Gφ culturen(Opgesteld in paragraaf 1). OPMERKING: Om de concentratie van Gφ in het gerecht voor verschillende analyses te verhogen, verwijder voorzichtig de helft van het medium. Zorg ervoor dat Gφ niet in het medium verwijderd worden gedetecteerd door het onderzoeken van het medium onder een lichtmicroscoop. Vervolgens intensief pipet de resterende medium te lichtvaardig gehandeld Gφ verwijderen. Centrifugeer het medium 10 minuten bij 200 xg en resuspendeer de pellet in 100 – 120 pl medium. Gebruik 100-120 ul van het medium dat de cellen voor elke dia. Bereid twee- of drievoud dia's van elke behandeling. Spin gedurende 7 minuten bij 84 x g. Droog de cellen gecentrifugeerd en bevestig de cellen met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten onder een chemische kap. Was 3x met PBS (~ 100 ul gedurende enkele seconden per wasbeurt). Voor intracellulaire kleuring, doorlaatbaar cellen met 0,5% Triton X-100 in PBS bij kamertemperatuur gedurende 10 min en was 5x met PBS. LET OP: In alle stadia, gebruik dan een geschikte buffer / oplossing Volume op de omtrek van de cellen op de schuif. Gebruik een hydrofobe barrière pen voor het bepalen van cellen perimeter. Let op: Paraformaldehyde is giftig. Aanraking met de huid en ogen vermijden. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Blok cellen met 10% normaal geit serum in RPMI-1640 medium en incubeer overnacht bij 4 ° C of bij kamertemperatuur gedurende 40 min. Wassen met PBS. Incubeer met enkel antilichaam (Ab) of een combinatie van muis en konijn primaire antilichamen (Abs) bij een 1: 100 verdunning (~ 100 pi). Incubeer overnacht (18-20 uur) bij 4 ° C. LET OP: Hier, muis monoklonale Abs inbegrepen: anti-CD14, anti-CD63, anti-CD66b, anti-cd1c, anti-CD15 en anti-cytochroom b-245 lichte keten (p22- phox identificatie). Konijn polyklonale Abs omvatten: anti-CD68, anti-CD36, anti-LC3B, anti-Myeloperoxidase, anti-neutrofiele elastase (NE), en anti-Nox2 / gp91- phOx Abs. Isotype controles opgenomen gezuiverd muis IgG1 en IgG2, en konijn IgG. prepare Abs volgens de instructies van de fabrikant en gebruik geschikt volume (ongeveer 100 ui) op de omtrek van de cellen omvatten. Was de cellen en incubeer met 1/400 secundaire antilichamen Cy2-CF (488A) geconjugeerde geit anti-konijn IgG (groen) en / of Cy5 (CF 647) geconjugeerd geit anti-muis IgG (rood) bij kamertemperatuur gedurende 40 min. OPMERKING: Verdun en bereid Abs volgens de instructies van de fabrikant. Na wassen, zet objectglaasjes met een druppel montage medium, bevattende 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) voor nucleaire kleuring, dan onmiddellijk in zijn dekglas. Analyseer de dia's door een confocale laser scanning systeem met behulp van fluorescentie microscoop en Plan Apo 40X immersie olie objectief. Voer de analyse binnen 30 minuten tot 2 uur na de bereiding van de objectglaasjes of bewaar bij 4 ° C overnacht. Bereken de cel gebied en de fluorescentie-intensiteit met behulp van een imaging software (zoals Image J). Voor co-lokalisatie, quantify door software met behulp van Manders Overlap Coëfficiënt (MOC) 17. OPMERKING: alleen cellen met MOC> 0,6 kan worden beschouwd als cellen met significante co-lokalisatie. 3. transmigratie van PMN Across endotheelcellen: Effecten van IL-8 op Giant fagocyt (Gφ) Formation LET OP: Gebruik 24-goed doorlatend celkweek inzetstukken voor de cel transmigratie assay. Coat de bovenste kamer van het inzetstuk met 150 gl fibronectine in een concentratie van 50 ug / ml, en laten kamertemperatuur gedurende 30 min. Naar de bovenste kamer 5 x 10 4 EA.hy926 endotheliale cellen / putje, geresuspendeerd in 150 pl geformuleerd Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (compleet groeimedium). OPMERKING: Zorg ervoor dat het endotheel monolaag is confluent voor gebruik. Aan de Tweede Kamer, voeg 700 ul van de complete groeimedium. Plaats het doorlaatbarecelkweek inserts in cluster trays en cultuur van de EA.hy926 endotheelcellen gedurende 2 dagen bij 37 ° C in 5% CO2. LET OP: In parallel, op de tweede dag vers bereid PMN (zoals beschreven in paragraaf 1). Na 2 dagen, vervangt het medium in de onderste en bovenste kamers van de inzetstukken. De onderste kamer, voeg RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FCS en IH-interleukine (IL) -8 bij een uiteindelijke concentratie van 50 nM / ml. Heeft IL-8 niet toe te voegen aan onderste kamers te controleren. Aan elke bovenste kamer, voeg 10 6 verse PMN in 100 ul RPMI-1640 medium aangevuld met 10% IH-FCS. Incubeer de cluster schalen bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 90 min. Na 90 min incubatie verwijderen van de cellen van de bovenste en onderste kamers afzonderlijk en tel elke subpopulatie. Express cellen in elke kamer als percentage van de totale cellen toegevoegd. OPMERKING: Verwijder voorzichtig cellen uit de bovenste chamber voorzichtig pipetteren om te voorkomen verwijderen endotheliale cellen en overbrengen naar een steriele buis. Verwijder de cellen van de onderste kamer door pipetteren en het wassen van de Tweede Kamer met 500 pi en transfer naar een tweede steriele buis. Pool 10 6 cellen uit verschillende bronnen van verhuizende (Tweede Kamer) en niet-migrerende (Eerste Kamer) PMN fracties en cultuur elk voor 7 dagen zonder groeifactoren, zoals gespecificeerd in de stappen 14-16 (deel 1). Spin cellen op dia 16 en analyseren van de ontwikkelde cellen in elke cultuur conditie door confocale microscopie zoals beschreven in hoofdstuk 2.

Representative Results

Neutrofielen Autophagocytosis en ontwikkeling in cultuur Autophagocytosis neutrofielen en hun ontwikkeling in Gφ binnen 7 dagen kweken is getoond in figuren 3 en 4. Per dag 4-7, grootte was enorm vergroot, 15 en autophagosytosis was merkbaar vanaf 90 minuten na co-kweken van de neutrofielen met fluorescerende vlekken membraan (PKH-26, red, PKH-67, groen). 14 Als een controle voor deze subpopulatie neutrofielen werden neutrofielen sommige culturen ook behandeld met GM-CSF / IL-4. De cytokine behandelde cellen groter geworden binnen 7-14 dagen in kweek zoals eerder beschreven. 18, 19 echter, waren kleiner dan Gφ en had cytoplasmatische uitsteeksels lijken DC-achtige cellen (Figuur 5), zoals eerder vermeld b y Oehler et al. 19 Ook de GM-CSF / IL-4 behandelde cellen waren negatief of had een lage CD66b expressie, 15 duidelijk aantoont morfologische en mogelijk functionele verschillen ook. Figuur 3: Autophagocytosis in de ontwikkelingslanden Giant Fagocyten (Gφ) in cultuur. Vers geïsoleerde gezuiverde neutrofielen werden gemerkt met PKH-67 (groen) of PKH-26 (rood) fluorescente kleurstoffen membraan op tijdstip nul en daarna samen gekweekt en vervolgens tot zeven dagen. De cellen werden gecentrifugeerd op objectglaasjes, werden kernen gekleurd met DAPI en monsters werden geanalyseerd met confocale microscopie. Autophagocytosis is nu al merkbaar na 90 min van de co-cultuur. Het samenvoegen van rood en groen in geel en oranje is duidelijk zichtbaar in de ontwikkeling van Gφ.bestanden / ftp_upload / 54826 / 54826fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Ontwikkeling van Giant Fagocyten (Gφ) in cultuur. Vers geïsoleerde gezuiverde neutrofielen werden gevolgd tot 7 dagen in de cultuur. De cellen werden gecentrifugeerd op glasplaatjes op de aangegeven tijdstippen, gekleurd met May-Grunewald Giemsa, en geanalyseerd met een helderveld microscopie. Een individu met weinig eosinofielen wordt gepresenteerd ter vergelijking. Merk op dat de grootte van eosinofielen ongewijzigd in kweek. Vergroting 100X olie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Vergelijking tussen de ontwikkeling van Giant Fagocyten (G φ) en GM-CSF / IL behandeld neutrofielen in Culture. (A) May Grunwald-Giemsa gekleurde neutrofielen gekweekt zonder (Gφ) en GM-CSF / IL-4 gedurende 7 dagen. Monsters werden geanalyseerd met een helder-veld microscopie. Vergroting, X40. Cellen ontwikkeld in kweken met medium, aangevuld met GM-CSF / IL-4 tonen wijdverspreide cytoplasmische projecties, maar zijn kleiner dan Gφ. (B) Vers geïsoleerde neutrofielen werden gelabeld met PKH-26 (rood) kleurstof en gekweekt in cytokine-vrij medium gedurende 7 dagen of gelabeld met PKH-67 (groen) kleurstof en gekweekt in medium aangevuld met GM-CSF / IL-4 voor 7 dagen. Daarna werden de ontwikkelde cellen gemengd in een 1: 1 verhouding en co-gekweekt gedurende 2 uur. Cellen werden gefixeerd en geanalyseerd met confocale microscopy. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie. 15 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Om verder te onderzoeken de loop van Gφ ontwikkeling, hun morfologische veranderingen ook gevolgd door time-lapse microscopie. Video-1 (dag 3 tot dag 4) en video-2 (dag 4 tot dag 5) tonen de ontwikkeling in gezuiverde neutrofielen culturen. Deze Gφ niet-klevende of licht klevende met een beperkte beweging capaciteit en actief innemen omliggende neutrofielen resten en afval. In video-3, wordt de beweging van monocyt-afgeleide MC en Gφ vergeleken in een gemengde monocyt / neutrofiel cultuur. De MC kruipt actief (links, niet-gemerkte cel). De Gφ (rechts), is helder PKH-26 gelabelde cel. Video-1: Toont de ontwikkeling van de Giant Fagocyten in gezuiverd PMN Cultures op dagen 3-4 door Time-lapse Microscopie. Neutrofielen werden gevolgd-up in de cultuur van dag 3 tot dag 4 door time-lapse microscopy.The time-lapse microscopie systeem bestaat uit omgekeerde gemotoriseerde fluorescentiemicroscoop, en een hoge resolutie B / W CCD-camera, met een op het podium incubator. Beeldopname overname van time-lapse werd genomen om de 10 min. Oorspronkelijk gepubliceerd in verwijzing 14 Klik hier om deze video te bekijken. Video-2: toont de ontwikkeling van Giant Fagocyten in gezuiverd PMN Culture on Days 4-5 by Time-lapse Microscopie. Neutrofielen werden gevolgd-up in de cultuur van dag 4 tot dag 5 van time-lapse microscopie. De time-lapse microscopie systeem bestaat uit gemotoriseerde geïnverteerde fluorescentiemicroscoop, en een hoge resolutie zwart / wit CCD-camera, een op het podium incubator. Beeldopname overname van time-lapse werd genomen om de 10 min. Klik hier om deze video te bekijken. Video-3: A Giant fagocyt en een macrofaag Ontwikkeld in co-cultuur. Monocyten / neutrofielen co-cultuur werd gevolgd-up van dag 4 tot dag 5 van time-lapse microscopie. -Monocyten afgeleide macrofagen (links); heldere (PKH-26-lood cel)-neutrofielen afgeleide giant fagocyt (rechts). De time-lapse microscopie systeem voor video is samengesteld uit omgekeerde gemotoriseerde fluorescerende MICRoscope en een hoge resolutie zwart / wit CCD-camera, een op het podium incubator. Beeldopname overname van time-lapse werd genomen om de 10 min. Oorspronkelijk gepubliceerd in verwijzing 14 Klik hier om deze video te bekijken. Expressie van Markers in Giant Fagocyten De oorsprong van neutrofiele Gφ werd geverifieerd door positieve expressie van de volgende merkers neutrofielen CD66b / CD63 / MPO / NE / CD15 (Figuur 6). De Gφ drukte ook NADPH oxidase, oxLDL de scavenger receptor – CD68 en CD36, en bevatte LC3B beklede vacuolen en aggregaten (geïdentificeerd door Western blotting als LC3BII 15), het aantonen van een Autofagie marker. Maar ze waren negatief voor monocytische afkomst (CD14, CD16 en CD163) en Dendritic-cellen (cd1c en CD141) markers, wat suggereert dat Gφ niet voortvloeide uit de vervuilende monocyten. Figuur 6: Expressie van verschillende markeringen voor neutrofielen, monocyten en dendritische cellen bij Giant Fagocyten (Gφ) na 7 dagen in cultuur. Positieve uitdrukking van de neutrofielen specifieke korrel marker CD66b, de azurophil korrels markers CD63 en MPO, neutrofielen elastase en CD15. Negatieve uitdrukking voor de dendritische cd1c en CD141 markers en monocytische lineage markers CD14, CD16 en CD163. Daarnaast Gφ sprak de autofagie marker LC3B, de scavenger receptoren CD68 en CD36 en de NADPH oxidase subeenheden Gp91-phox / p22-phOx subeenheden. Kernen werden gekleurd met DAPI en monsters door confocale microscopie. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van gevonden. 14 , 15 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Functies van Gφ – NADPH oxidase Activation, ROS Productie en Phagocytosis: Fagocytose van latexkralen en geopsoniseerd zymosan bleek uit Gφ. Gφ ook gegenereerd basale ROS (figuur 7A) en reageerde op zymosan en PMA stimulatie door oxidatieve burst (Figuur 7B-D). Anders dan monocyten of neutrofielen, Gφ gegenereerd ROS ook als reactie op stimulatie oxLDL en werden gekleurd met Oil Red O (Figuur 7B, F). Van de nota, de behandeling van verse neutrofielen met de NADPH-oxidase inhibitor – DPI, niet alleen geremd ROS productie, maar ook prevented Gφ formatie in cultuur, wat suggereert dat ROS signalering is essentieel voor Gφ formatie. 14, 15 Figuur 7: Oxidatieve Burst, fagocytose, en oxLDL Opname door Giant Fagocyten (Gφ). (A) Basale ROS productie is duidelijk in lysosomen van Gφ. (B) ROS productie in reactie op geoxideerd LDL (oxLDL), PMA en zymosan (zijn zymosan deeltjes duidelijk vermeld). (C) Nitroblue tetrazolium (NBT) test Gφ tonen respiratory burst activiteit zonder en met PMA (dia's zijn onbesmet, maar de inzetstukken zijn gekleurd met May-Grunwald Giemsa). (D) NBT-test en mei Grunewald-Giemsa gekleurd Gφ met PMA en PMA / DPI, die NADPH oxidase en ROS geremd. (E) fagocytose van Latex en IgG-opsonized zymosan in PKH-26 (rood) gekleurde cellen. (F) Oil Red O kleuring in onbehandelde en oxLDL behandeld Gφ. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van gevonden. 14, 15 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Transmigratie van PMN Across endotheelcellen Om mogelijke neutrofielen subpopulaties die kunnen ontwikkelen tot Gφ identificeren, de migratie van neutrofielen tot endotheliale celmonolagen werd bepaald (figuur 8A). Na 90 min, 62,3 ± 12,2% van de neutrofielen transmigrated tot endotheelcellen aan IL-8 in het onderste compartiment. Van de nota, Gφ positief voor CD66b / CD15 / LC3B alleen ontwikkeld vanuit de transmigrated bevolking van neutrofielen, terwijl de cellen die ontwikkeld op basis van de niet-migrerende neutrofielen fractie waren kleiner in omvang en negatief voor de neutrofiele markers CD66b / CD15 (Figuur 8B, 8C) . Figuur 8: Effecten van IL-8-afhankelijke PMN Transmigration Door endotheelcellen op Giant fagocyt (Gφ) Formation. (A) Een schema illustreert neutrofielen transmigratie assay in monolagen van endotheelcellen (EC) naar IL-8. Deze test kan worden beschouwd als een model voor neutrofielen rekrutering van acute inflammatoire plaatsen. (B – C) In de celmigratie assay (gespecificeerd in protocol 3), transmigreren (B) en niet-migrerende (C) neutrofielen fracgen werden gekweekt gedurende zeven dagen zonder groeifactoren (zoals in protocol 1). Daarna werden de cellen afgedraaid op glasplaatjes en geanalyseerd met confocale microscopie. Vaste cellen werden gekleurd voor CD66b (rood), LC3B (groen) en CD15 (rood). Kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Giant fagocyten (Gφ) zijn een nieuw gedefinieerde subpopulatie van neutrofielen afgeleide cellen die fundamentele en specifieke neutrofiele markers zoals CD66b / CD15 / CD63 / MPO / NE. Dit type van neutrofielen afgeleide fagocyt niet in de literatuur hiervoor beschreven. In tegenstelling tot de neutrofielen die van korte duur zijn en ondergaan apoptose, Gφ zijn annexine-V-negatief en verlengde levensduur te geven. Maar, zoals neutrofielen, Gφ ook internaliseren deeltjes produceert NADPH oxidase-afhankelijke ROS reactie op deze deeltjes en PMA. Echter, hun vermogen om te internaliseren OxLDL en daardoor te produceren ROS zijn unieke kenmerken van Gφ. ¹⁴

Een aantal factoren bleken be'invloeden in kweek. Het gebrek aan externe cytokinen of groeifactoren in het groeimedium essentieel (in het bijzonder GM-CSF / IL-4). Echter, neutrofielen migratie naar IL-8 bleek een onderscheidende factor tussen degenen die devweggelopen in Gφ en die dat niet deden. Ook internalisatie puin gevolg van apoptotische neutrofielen, de expressie van eiwitten autofagie (LC3B) en functionele NADPH oxidase, werden alle getoonde dwingende noodzaak voor de ontwikkeling daarvan, omdat hun remming voorkomen Gφ vorming (figuur 1). Blijkbaar is de ontwikkeling van deze reuzencellen gevolg van neutrofielen verschilt van die karakteriseren giant celopbouw van de monocyt / macrofagen. De laatste vorm multi-kernhoudende reuzencellen geassocieerd met diverse chronische ontstekingsziekten, ^{^20,} ²¹ terwijl de neutrofiele Gφ hier beschreven ontwikkelen via autophagocytosis door engulfing celrestanten en blijven meestal mono-gekiemd gedurende hun ontwikkeling, ¹⁴ (zelden echter soms een tweede kern kan worden waargenomen). Bovendien is een aantal controles vestigden hun neutrofiele herkomst: (1) Expresie van de specifieke neutropilic markers en afwezigheid van dendritische en monocytische afkomst markers, (2) hun belemmerd ontwikkeling in monocyten / PMN co-culturen, (3) hun verschillende bewegingspatronen in kweek van macrofagen (zoals bewezen door beeldvorming van levende cellen en tijd -lapse microscopie), ¹⁴ (4) hun licht vasthouden aan plastic schaaltjes en (5) de ontwikkeling van zuivere CD15 ⁺ / CD14 ^– PMN overgenomen door flowcytometrie.

Enkele van de functies die in-vitro kunnen geven ons aanwijzingen om hun potentieel functies in vivo. Een Autofagie eiwit dat bijdraagt aan de vermindering van ontsteking via regelgevende interacties met aangeboren immuunsysteem signaalroutes, ²² – – bijvoorbeeld de mogelijkheden van Gφ grote hoeveelheden neutrofielen korrels en brokstukken, de aanwezigheid van grote vacuolen en de expressie LC3B consumeren allemaal ondersteuning scavenging vaardigheden. Als zodanigDeze resultaten geven ook aan dat Gφ kunnen functioneren op ontstoken plaatsen waar de MC / DC systeem onvoldoende of overweldigd, en derhalve bijdragen aan het oplossen van ontsteking. Dit idee zou kunnen worden ondersteund door het feit dat in gemengde monocyten / neutrofielen culturen Gφ ontwikkeling wordt belemmerd. ¹⁴ Ook Aangezien Gφ expressie oxLDL scavenger receptor (CD36, CD68), oxLDL internaliseren en ROS productie in reactie daarop, kunnen van deze betrokken zijn bij atherosclerotische processen ontsteking lossen. Sinds Gφ ontwikkeld alleen vanuit neutrofielen die in de richting van IL-8 gemigreerd en transmigratie neutrofielen 'over endotheliale monolagen in de richting van IL-8 vertegenwoordigt neutrofielen rekrutering van acute ontstekingen sites, ook deze bevinding kan anti-inflammatoire functies te ondersteunen. Omgekeerd kan de prestatie van Gφ in bepaalde ontstekingen zodat zij granule bestanddelen en ROS ontladen draagt zodoende bij tot perconsistente ontstekingen en weefselschade. ²⁰ Echter, over het algemeen, hun autofagocytische vaardigheden aan te geven dat Gφ waarschijnlijk betrokken zijn bij het verminderen van de ontstekingsreactie in plaats van het bestendigen van het.

Interessant genoeg hebben we recent geïdentificeerde aanwezigheid van Gφ in humane atherosclerotische plaques. (in voorbereiding). Toch is een groot aantal vragen nog moeten worden ontrafeld. Zo zijn Gφ pro- of anti-inflammatoire? Wat zijn de factoren die de vorming en functie in vitro of in vivo bepaald? Welke specifieke neutrofielen subpopulatie is hun voorloper cel die hun ontwikkeling bevordert in Gφ? Zijn ze geassocieerd met bepaalde pathologieën en welke? Gezamenlijk stellen van interessante vragen met betrekking tot de herkomst en mogelijke functies.

Maar kritische stappen en valkuilen binnen het protocol moet in het achterhoofd worden gehouden. Een kritische stap in de ontwikkeling van Gφ is kweken van de pure neutrofielen in middelgrote verstoken van cytokines, groeifactoren of antibiotica. Een andere belangrijke stap is om uit te sluiten dat Gφ ontwikkelen van besmetting van monocyten en de neutrofiele oorsprong van Gφ vast te stellen. Nadat dus bloed scheiding door discontinue gradiënt, de neutrofielen werden verder onderworpen aan een bijkomende zuiveringsstap door flowcytometrie behulp granulocyten gating en CD15 ⁺ / CD14 ^– markers. De ontwikkelde Gφ verkregen neutrofielen die verder werden gezuiverd met flowcytometrie scheiding niet verschillen van die die niet zijn onderworpen aan deze zuiveringsstap. Daarom zijn de meeste van de experimenten werden uitgevoerd zonder flowcytometrie zuiveringsstap door extra celverlies. Van de nota, in sommige zeldzame gevallen een aantal eosinofielen werden genoteerd in de cultuur. Hun grootte ongewijzigd gebleven gedurende de kweekperiode. We moeten ook rekening mee dat, hoewel er een aantal methodenvoor neutrofielen scheiding van menselijk bloed, de hier beschreven methode is de enige methode die wij gebruikt en daarom kunnen we niet Gφ ontwikkeling vergelijken met andere beschikbare werkwijzen voor scheiding neutrofielen.

Een belangrijke valkuil bij het onderzoek Gφ gevolg van het onvermogen om voldoende zuivere populatie Gφ geschikt voor diverse biochemische assays te verkrijgen. Het is bijna onmogelijk de omstandigheden onze experimenten werden uitgevoerd. Ten eerste, de opbrengst aan Gφ laag. Van 1,0 x 10 ⁶ PMN geënt ongeveer 100-200 Gφ ontwikkelen na zeven dagen in kweek, afhankelijk van de bloeddonor. Ten tweede is het in principe moeilijk om op dit moment de ontwikkelde Gφ in kweek te scheiden van de resterende neutrofielen puin in de schaal. Deze beperkingen was het praktisch onmogelijk om de cellen geanalyseerd door middel van biochemische of moleculaire biologische werkwijzen. Daarom wordt dit protocol gericht op het beschrijven Gφ identificatie en functie door het gebruik van lichten confocale microscopie. Hun morfologische transformatie van neutrofielen in Gφ in cultuur werd ook gevolgd door live-cell imaging en time lapse microscopie. ¹⁴ Blijkbaar veel grotere hoeveelheden bloed kan nodig zijn om de biochemische of moleculaire biologie methoden toe te passen en het overwinnen van de lage opbrengst verkregen en het scheiden van de levensvatbare Gφ uit puin neutrofielen 'in het gerecht.

Samengevat, hebben we onlangs beschreven voor het eerst de ontwikkeling van Gφ in kweek, een subpopulatie van langlevende fagocyten van neutrofiele oorsprong. Daarom is dit de enige methode die momenteel beschikbaar Gφ verkrijgen in kweek, hoewel de twee belangrijkste beperkingen bovenstaande elementen moeten worden overwonnen (de lage opbrengst van de Gφ verkregen in kweek en het onvermogen om de ontwikkelde Gφ van neutrofielen afval gescheiden in de kweek schotel). Toch, de voorbereiding en identificatie, in dit protocol, is essential voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in ontstekingsreacties en neutrofielen biologie en plasticiteit, om verder te onderzoeken de mogelijke betekenis en functies van Gφ.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs danken dr Edith Suss-Toby voor haar onschatbare hulp bij de confocale microscopie studies. Deze studie werd ondersteund door het ministerie van Immigratie Absorptie en het Comité voor de planning en budgettering van de Raad voor het Hoger Onderwijs in het kader van het programma Kamea (LD en AP). We hebben ook zeer erkentelijk voor de steun van de Research Fellow van de Lady Davis Stichting Post-Doctoral Research Fellowship (OR).

Materials

Sterile scalp vein set (21GX3/4)	Bio Diagnostics Ltd.	# 20080312	A strile needle for venipancture
VACUETTE HOLDEX Single-Use Holder PP	Greiner Bio-One	# 450263	For securing during venipuncture
VACUETTE Tube K3E K3EDTA (16×100/9 ml)	Greiner Bio-One	# 455036	Sterile tube for blood collection
Nunclon MultiDish (24 wellx1ml)	Thermo Scientific	# 142475
Polypropylene conical centrifuge tube (50 ml)	Greiner Bio-One	# E14103PJ
Transwell-24 well (transmigration assay)	Corning	# CA-3415	Polycarbonate membrane, 6.5 mm diameter, 3 μm pores)
RPMI-1640 medium	BioIndustries	# 01-100-1A	Do not add antibiotics
EA.hy926 (ATCC CRL2922)	BioIndustries	# CRL-2922
ATCC-formulated Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	BioIndustries	# 302002	complete growth medium
Polysucrose – Histopaque1119	Sigma-Aldrich	# 1119-1	Tissue culture grade
Polysucrose – Histopaque1077	Sigma-Aldrich	# 1077-1	Tissue culture grade
Phosphate buffered saline (PBS) – ion free	BioIndustries	# 02-023-1A	Cell biology and molecular biology grade
Heat inactivated Fetal calf serum (HI-FCS)	BioIndustries	# 04-121-1B	Cell biology grade or tissue culture grade, low LPS
NaCl	Sigma	# S3014	Molecular biology grade, suitable for cell culture
Paraformaldehyde, 16%	Electron Microscopy Sciences	# 15710	Cell bology grade or tissue culture grade (only 16% PFA)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	# 9002-93-1	Molecular biology grade
Normal Goat Serum	BioIndustries	# 04-009-1	Cell biology and molecular biology grade
Trypan blue	BioIndustries	# 031021B	Tissue culture grade
May-Grünwald	Sigma-Aldrich	# MG500	Cell biology grade-(procedure No GS-10)
Giemsa stain Kit	Sigma	# 48900	Cell biololgy grade-(procedure No GS-10)
Fibronectin	BioIndustries	# 03090105
Human Interleukin-8 (CXCL8)	PeproTech	# 200-08-5
Anti-CD14 (clone 5A3B11B5)	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-58951	Mouse IgG2b; expressed by monocytes
Anti-CD63 (clone MX-49.129.5)	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-5275	Mouse IgG1; expressed by neutrophils
Anti-CD66b (clone 80H3)	AbD Serotec	# MCA216	Mouse IgG1; expressed by neutrophils
Anti-CD1c (BDCA-1) (clone AD5-8E7)	MACS Miltenyi Biotec	# 130-090-695	Mouse IgG2a; expressed by dendritic cells
Anti-CD15 (clone MY-1)	Abcam	# ab754	Mouse IgM; expressed by neutrophils
Anti-Cytochrome b-245 Light Chain (p22-phox) (clone 44.1)	BioLegend	# 650001	Mouse IgG2a; to recognize neutrophil NADPH oxidase complex
Anti-CD68	Protein Tech	# 16192-1-AP	Rabbit IgG; to recognize oxLDL scavenger receptor
Anti-LC3B	Sigma	# L7543	Rabbit IgG
Anti-Myeloperoxidase	Abcam	# ab45977	Rabbit IgG
Anti-Neutrophil elastase	Calbiochem	# 481001	Rabbit IgG
Anti-NOX2 (gp91-phox)	Abcam	# ab131083	Rabbit IgG
Anti-CD36 (SR-B3)	Novus Biologicals	# NB400-144	Rabbit IgG
Purified Mouse IgG1, κ Isotype Control (clone MG1-45)	BioLegend	# 401401	Antibody used as isotype control
Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control (clone MOPC-173)	BioLegend	# 400263	Antibody used as isotype control
Normal rabbit IgG	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-2027	Antibody used as isotype control
CF488A Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Biotium	# 20012	Anti-Rabbit IgG with the green fluorescent dye CF488A
CF647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Biotium	# 20043	Anti-Rabbit IgG with the red fluorescent dye CF647
CF488A Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Biotium	# 20010	Anti-Mouse IgG with the green fluorescent dye CF488A
CF647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Biotium	# 20040	Anti-Mouse IgG with the red fluorescent dye CF647
Fluorescent Mounting Medium with DAPI	Vectashield H-1000; Vector Lab Inc.	# E19-18	Nuclear staining
Confocal laser scanning microscope (LSM 700)	Carl Zeiss	Ser.# 3523000380	Plan Apo x40 immersion oil objective
Zeiss CLSM software (ZEN 2010)	Carl Zeiss MicroImaging GmbH	version 6.0	For colocalization analysis
ImageJ software	Wayne Rasband, NIH, USA	version 1.49k	For determination of cell areas and fluorescence intensity
Light microscope (Axiovert 25)	Carl Zeiss	Ser.# 201060153	Examination of cells in culture
Centrifuge (Megafuge 1.0 R)	Heraeus Instruments	# D-37520	Cells separation from blood; cytospins preparation
Inverted fluorescent microscope (Zeiss Axio Observer Z.1)	Carl Zeiss	Ser.# 3834001470	Demonstration of giant phagocytes development
Temperature-controlled incubation system (Cube&Box)	Life Imaging Services		Temperature control system for microscopes
High resolution digital CCD camera (AxioCam HRm)	Carl Zeiss	Ser.# 117090279	For capturing high-contrast image data from an examined cell objects

References

Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
Silva, M. T., Correia-Neves, M. Neutrophils and macrophages: the main partners of phagocyte cell systems. Front. Immunol. 3, 174 (2012).
Cowburn, A. S., Condliffe, A. M., Farahi, N., Summers, C., Chilvers, E. R. Advances in neutrophil biology: clinical implications. Chest. 134, 606-612 (2008).
Duffin, R., Leitch, A. E., Fox, S., Haslett, C., Rossi, A. G. Targeting granulocyte apoptosis: mechanisms, models, and therapies. Immunol. Rev. 236, 28-40 (2010).
Silva, M. T. Macrophage phagocytosis of neutrophils at inflammatory/infectious foci: a cooperative mechanism in the control of infection and infectious inflammation. J. Leukoc. Biol. 89, 675-683 (2011).
Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
Cassatella, M. A., Locati, M., Mantovani, A. Never underestimate the power of a neutrophil. Immunity. 31, 698-700 (2009).
Zhang, X., Majlessi, L., Deriaud, E., Leclerc, C., Lo-Man, R. Coactivation of Syk kinase and MyD88 adaptor protein pathways by bacteria promotes regulatory properties of neutrophils. Immunity. 31, 761-771 (2009).
Araki, H., et al. Reprogramming of human postmitotic neutrophils into macrophages by growth factors. Blood. 103, 2973-2980 (2004).
Iking-Konert, C., et al. Up-regulation of the dendritic cell marker CD83 on polymorphonuclear neutrophils (PMN): divergent expression in acute bacterial infections and chronic inflammatory disease. Clin. Exp. Immunol. 130, 501-508 (2002).
Rydell-Tormanen, K., Uller, L., Erjefalt, J. S. Neutrophil cannibalism–a back up when the macrophage clearance system is insufficient. Resp. Res. 7, 143 (2006).
Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. J. Leukoc. Biol. 90, 271-284 (2011).
Dyugovskaya, L., Berger, S., Polyakov, A., Lavie, L. The development of giant phagocytes in long-term neutrophil cultures. J. Leukoc. Biol. 96, 511-521 (2014).
Dyugovskaya, L., Berger, S., Polyakov, A., Lavie, P., Lavie, L. Intermittent Hypoxia Affects the Spontaneous Differentiation In Vitro of Human Neutrophils into Long-Lived Giant Phatocytes. Oxid. Med. Cell. Longev. , 9636937 (2016).
Mihalache, C. C., et al. Inflammation-associated autophagy-related programmed necrotic death of human neutrophils characterized by organelle fusion events. J. Immunol. 186, 6532-6542 (2011).
Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of Colocalization of Objects in Dual-Color Confocal Images. J. Microsc. 169, 375-382 (1993).
Matsushima, H., et al. Neutrophil differentiation into a unique hybrid population exhibiting dual phenotype and functionality of neutrophils and dendritic cells. Blood. 121, 1677-1689 (2013).
Oehler, L., et al. Neutrophil granulocyte-committed cells can be driven to acquire dendritic cell characteristics. J. Exp. Med. 187, 1019-1028 (1998).
Berton, G. Editorial: Gigantism: a new way to prolong neutrophil life. J. Leukoc. Biol. 96, 505-506 (2014).
Milde, R., et al. Multinucleated Giant Cells Are Specialized for Complement-Mediated Phagocytosis and Large Target Destruction. Cell. Rep. 13, 1937-1948 (2015).
Deretic, V., Saitoh, T., Akira, S. Autophagy in infection, inflammation and immunity. Nat. Rev. Immunol. 13, 722-737 (2013).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Lavie, L., Dyugovskaya, L., Polyakov, A., Rogovoy, O., Leder, E. Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro. J. Vis. Exp. (119), e54826, doi:10.3791/54826 (2017).