Voorbereiding van de rAAV9 tot overexpressie of Knockdown Genes in Mouse Hearts

Regelen expressie of activiteit van specifieke genen in verschillende biologische systemen is een waardevol strategie het onderzoek van genfunctie ^1. Een directe manier van de verwezenlijking van dit doel is om nucleotidesequenties te manipuleren en het genereren van mutante allelen. Hoewel het maken van nauwkeurige, doelgerichte wijzigingen aan het genoom van levende cellen nog een tijdrovend en arbeidsintensief praktijk, de ontwikkeling van de machtige TALEN en CRISPR / Cas9 gereedschap heeft een nieuw tijdperk van het genoom bewerken ^2-5 geopend. Een routine laboratorium methode voor genetische manipulatie heeft zich gericht op de introductie van genetisch materiaal (DNA en RNA's die coderende sequenties of siRNA / shRNAs) in de cellen uit te drukken of knockdown het gen (s) van belang ^1,6.

In veel gevallen, de belangrijke hinderpaal voor genmanipulatie is de afgifte van DNA, RNA of eiwit in de cellen. Wat in vitro studies, efficiënt transfectiop systemen zijn vastgesteld in veel gekweekte cellijnen. In het muismodel met name in vivo genafgifte is moeilijker. Er zijn een aantal extra- en intracellulaire barrières die moeten worden gepasseerd om efficiënte cellulaire opname van exogeen reagens bereiken. Extra obstakels onder meer de snelle klaring en de korte duur van de geleverde materialen ^7,8. Een strategie om deze problemen te omzeilen is om virale vectoren als "dragers" of "auto" in vivo genafgifte. De natuur geëvolueerd transductie eigenschappen van virussen mogelijk maken de efficiënte levering van een gen van belang in cellen ^7,9,10. Talrijke types van virale vectoren zijn ontwikkeld en maken flexibele in vivo genmanipulatie in verschillende organen en cellen in muizen.

De meest gebruikte virale systemen omvatten Retrovirus, Lentivirus, adenovirus en adeno-geassocieerde virus (AAV) <sup> 11. Retrovirussen zijn enkelstrengs RNA-virussen en hun genetisch materiaal naar het gastheergenoom op stabiele wijze gedurende mitose voeren, waardoor nog levenslange expressie van het getransduceerde genen in de doelwitcellen en organen ^12-14. Veel soorten retrovirussen alleen delende cellen infecteren en hun doeltreffendheid in niet-delende cellen zeer laag ^15. Dit beperkt hun nut voor gen-levering. Lentivirus is een geslacht van de familie Retroviridae. Anders dan andere retrovirussen, Lentivirus kan zowel delende als niet-delende cellen infecteren en is op grote schaal gebruikt voor genoverdracht in post-mitotisch en zeer gedifferentieerde cellen ^16. De levenscyclus van Lentivirus omvat ook de integratie van vector DNA in het gastheergenoom. Aldus Lentivirus-gemedieerde genafgifte worden stabiele en langdurige expressie van het getransduceerde genetische elementen ^16-18. Dit kan echter voorzien van een double-e vertegenwoordigendged zwaard in het gebruik van deze virussen om genexpressie te manipuleren, de integratie van vector DNA kan leiden tot mutagenese in de gastheercellen en kunnen artefact veroorzaken. Adenovirus andere veelgebruikte genafgiftesysteem. Anders dan retrovirussen en lentivirussen, adenovirussen zijn niet geïntegreerd en niet interfereren met de genomische integriteit van gastheercellen ^8,10,11,19. Bovendien kunnen adenovirussen transfecteren DNA in vele celtypen, en infectie niet afhankelijk actieve celdeling ^19. Een ander belangrijk kenmerk van adenovirussen is het gemak van vector zuivering als virale vectoren de mogelijkheid te repliceren ^19,20. De belangrijkste nadeel van dit systeem is dat adenovirus infectie kan leiden tot sterke immuunresponsen in doelwitcellen en organen ^19, beperkt het gebruik ervan in verschillende onderzoeken, in het bijzonder bij gentherapie studies.

Vergeleken met deze verschillende typens van virale vectoren, wordt recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) naar het ideale genafgiftesysteem ^21,22 zijn. Het vertoont een minimale immunogeniciteit en pathogeniciteit ^23,24. Bovendien rAAV infecteert een breed scala aan celtypen, waaronder zowel verdelen en niet-delende cellen. In de meeste gevallen is rAAV niet te integreren in ontvangst genomen; waardoor het risico van ongewenste genetische of genomische veranderingen in de doelcellen laag ^22.

Recentelijk rAAV systemen met succes gebruikt voor de in vivo afgifte van DNA coderend voor eiwitten, miRNAs, shRNAs en CRISPR-gRNAs in muis hartspier ^23,25-29. Deze methode heeft fundamenteel onderzoek en gentherapie studies vergemakkelijkt het gebied van cardiovasculair onderzoek. Hier, de gedetailleerde procedure om rAAV9 vectoren die efficiënt overexpressie of knockdown de genen van belang in muisharten werd beschreven te genereren. Het protocol voorziet in een eenvoudige en effectieve methodemanipuleren van cardiale genexpressie in muizen experimentele modellen.