組織学でMRIをマージするために、3D印刷技術を活用：脳セクショニングのためのプロトコルを

全ての動物取り扱いおよび本明細書に記載の手順は、神経疾患の国立研究所と脳卒中動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って実施しました。脳は、EAEを発症するように誘導され、共通のマーモセット（ マーモセット属コモンマーモセット ）から収集しました。 11脳を3週間、4％パラホルムアルデヒドtranscardial灌流による安楽死の後一年の間に10％ホルマリン中で保存しました。 1.死後MRIの準備と取得 マーモセットの脳 フッ素系オイル、パラフィン、およびマーモセットの脳の綿ガーゼ、50ミリリットルの遠心分離管、小さなへら、〜30mlでワークステーションを準備します。 20ミリリットルマークにフッ素系オイルやガーゼでチューブを埋めます。道に沿って気泡を除去するためにガーゼを圧縮します。 ペーパータオルで脳の表面から乾いホルマリン。の底部に向かって前頭極で脳を挿入テレビ。慎重にその位置を固定する側面の周りより多くのガーゼを使用してチューブに脳を固定します。追加のMRIスキャンの設定のためのMRI脳クレードルを作成する方法のための補助的なセクション11を参照してください。 ガーゼやフッ素系オイルとチューブの残りの部分を埋めます。慎重に道に沿って気泡を除去。キャップを固定し、パラフィンでチューブを密封します。 大脳縦裂に沿ってキャップをマークします。ペーパータオルでチューブをラップし、マーク上部中央とコイルに挿入します。 2DスピンエコーT2を取得します。パラメータを表1に示します。 Mipavで10解剖学的150ミクロンT2-weigted買収を開き、6 回目の買収に登録します。 注：登録はパウエルの呼び出しブレントの検索アルゴリズムで、自由、窓付きのsinc補間、正規化相互相関コスト関数の9度と最適化された自動登録の3.5Dアルゴリズムです。回転は10からサンプリングしました6; 1°をインクリメント5度をインクリメント粗い回転と細かい回転に-10°です。次に、登録画像を平均化：ユーティリティ、イメージの電卓バルク画像、平均。 人間の脳 中脳のレベルでのカットを使用して、脳幹から前脳を分離します。 10半球はまた、正中線ダウンカットで分離することができます。 一方の端部に半球ドーム、他端に注ぎ口を有する円筒形の管で前脳を置きます。 注ぎ口を介してフッ素系オイルでチューブを埋めます。注ぎ口を通して〜30分の穏やかな吸引を使用して気泡を除去。 3D T1-MPRAGEを取得します。パラメータを表1に示します。 2.解凍脳表面：Mipav 7.2 冠状向きでMRIを開きます。 アルゴリズム、変換ツール、変換、再サンプルを選択します。ユーザー定義サイズを選択して、ISOTにリサンプリングropicボクセル：0.1×0.1×0.1ミリメートル。 Brain_MRI_ResampledとしてリサンプリングMRIを保存します。人間：等方性ボクセル0.3×0.3×0.3ミリメートルにリサンプリング。 アルゴリズム、フィルタ（空間）、非線形ノイズリダクション]を選択します。デフォルトの設定を使用して、[OK]をクリックします。 表示ルックアップテーブルを選択し、二重しきい値]ボタンをクリックします。脳全体をカバーするために、グラフ上のスライダーをドラッグします。 最小/最大を使用してアルゴリズム、セグメンテーション、しきい値、しきい値を選択します。 「下限」ボックスに（ちょうどスケールの下）強度グラフの左下隅にある値を入力します。出力画像タイプのために「バイナリ」を選択し、チェックを外し、「反転しきい値を。」 アルゴリズム、形態素を選択して、穴を埋めます。 「2.5Dでのプロセス」をチェックこれは完全な脳のMRIであるため、満たされる必要がある後脳および皮質の間にいくつかの空のスペースがあります。人間の脳：このステップをスキップします。 ラインVOIを使用して、接続に描きます最も外側にある点で、脳の両側の後脳および皮質の間。脳を介してこれを続けます。 VOI、VOI変換、バイナリマスクにすべてを選択します。ユーティリティを選択し、画像の電卓。選択OR演算子]ドロップダウンメニューから、脳のマスクを選択します。 「デスティネーションイメージの種類を推進する」を選択アルゴリズム、形態素を選択して、穴を埋めます。チェック "2.5Dでのプロセス」 Brain_Model.niiなどのバイナリマスクを保存します。 アルゴリズム、抽出表面（マーチングキューブ）を選択します。マスク画像を選択し、Brain_Model.plyとして保存します。 3.スライス選択場所：Mipav 7.2 興味や開始位置の組織を識別します。意図されたスラブの厚さを計算します。マーモセットの脳では、セクションごとに30 MRIスライス、およびブレードギャップあたり5 MRIスライスを、カウントが〜3.5ミリメートルのスラブで、その結果、0.5ミリメートルブレードギャップが3mmのセクションを作成します。人間の脳：セクションあたり20 MRIのスライス、および4のMRI SLブレードギャップあたりの氷は、〜7.2ミリメートルのスラブで、その結果、1.2ミリメートルブレードギャップを有する6ミリメートルのセクションを作成します。 第1ブレードギャップの位置では、「ボックスVOI」をクリックし、脳の上にボックスを描画します。それを選択するために、ボックスの内側をクリックします。コピーとブレードギャップに対応する各MRIスライスの輪郭を貼り付けます。 切片厚に対応するMRIスライスの数によって前方にスキップして次のブレードギャップに対応する輪郭をコピーして貼り付けます。脳を介してこのプロセスを繰り返します。 VOI、VOIの変換、バイナリマスクにすべてを選択します。 Blade_Gaps.niiとして保存します。 アルゴリズム、抽出表面（マーチングキューブ）、マスク画像、Blade_Gaps.plyを選択します 。 4. MRIブレードマップの作成：Mipav 7.2 Brain_MRI_ResampledとBlade_Gaps.nii画像を開きます。 Blade_Gaps.niiイメージが選択すると、ユーティリティを選択し、画像の数学。画像タイプと乗算を推進選択します。値として万を入力します。 ユーティリティを選択し、画像の電卓。 [追加]を選択して、[画像]ドロップダウンボックスからBrain_MRI_Resampledイメージを選択します。先の画像の種類を推進選択します。 Brain_BladeMap.niiとしてこのイメージを保存します。 Triplanarビューをクリックすることで、脳がスライスされた場所は、三つの直交ビューで見ることができます。 5.脳とブレードギャップサーフェスをインポート：Netfabbプロフェッショナルパートを選択し、部品を追加します。ファイルBrain_Model.plyとBlade_Gaps.plyを選択します。 脳を選択し、修復モードをクリックしてください。修復モードでは： シェルの選択]ボタンをクリックし、脳をクリックしてください。 他のメッシュを選択するためのトグル選択ボタンをクリックします。他のメッシュを削除するには、Removeをクリックします。 適用修復をクリックし、古い部分を削除します。 右脳をクリックしてください。移動を選択します。クリックします。原点ボタンに。表示されるXYZパラメータを記録します。これらの翻訳パラメータはMipavで設定ブレードの位置を維持するために必要とされます。翻訳をクリックします。その後、ウィンドウを閉じます。 （複数回を変換]をクリックしないでください。それは、再び同じパラメータを使用して変換します。） Blade_Gapsモデルを選択します。右の部分をクリックし、移動を選択します。 XYZパラメータボックスに、以前に記録されたXYZ値を入力します。今すぐ翻訳をクリックしてウィンドウを閉じます。 Brain_Modelモデルを選択し、修復モードをクリックしてください。修復モードでは： シェルの選択]ボタンをクリックし、脳をクリックしてください。 右クリックして、スムーズな三角形を選択します。 4-5回の反復を入力します。防止のボリューム縮小を確認してください。人間の脳：1-2の繰り返し。 右クリックして、三角形を減らして選択します。ターゲット三角形カウントで200000を入力して、[実行]をクリックします。 自動修復、デフォルトの修理をクリックします。そして、適用の修復をクリックします右クリックし、名前を変更します。 Smoothed_Brain_Modelとして平滑化された脳の名前を変更します。 Smoothed_Brain_Modelを選択します 。右クリックし、エクスポート、STL。 6.編集脳等高線：Meshmixer MeshmixerにSmoothed_Brain_Modelをインポートします。 メッシュへの調整を行うために彫刻し、選択ツールを使用してください。編集が含まれます： 堅牢な滑らかなスカルプトツールを使用してください。ラインのVOIに対応する領域を滑らか。人間の脳：このステップをスキップします。 ボックスに伏せされる皮質の表面を滑らかに。 メッシングや編集プロセスで作成されている可能性があり、小さなくぼみを離れて滑らか。 分析、インスペクタ、Autorepairすべてを選択します。 Smoothed_Edited_Brain_ModelとしてSmoothed_Brain_Modelをエクスポートします 。 7.脳スライサーボックスの作成：Netfabbプロフェッショナルパートを選択し、パートを追加します。フィルを選択してください電子Smoothed_Edited_Brain_Model。 パートを選択し、パートを追加します。そして、STLファイルブレインスライサーParts_Marmosetを選択し、[開く]をクリックします。人間の脳： 脳スライサーParts_Human（補足コードファイル）。 右の部分をクリックすると、部品に拡張、シェルを選択します。各部分を個別に選択し、右に名前を変更する]をクリックします。 （オブジェクトの隣に目をクリックすると、それを隠したり、それが表示されるようになります。） ビッグボックスメイン 、小さなボックスのサブ 、および切断ボックスBox_Cutout、六角形状Blade_Holder_Main、小型フラットボックスミクロトームブレード 、およびハーフの名前を変更しますチューブオブジェクトクレードル 。人間の脳：なしBlade_Holder_Main、 ミクロトームブレード 、またはクレードル 。 メイン 、 サブ 、 ブレイド、Blade_Holder_Main、 ミクロトームブレード 、およびクレードルを非表示にし、すべての6とBox_Cutoutを選択するために、シフトセレクトを使用しています。 Box_CutoutとSmoothed_Edのみited_Brain_Modelが見えるはずですが、Smoothed_Edited_Brain_Modelを選択すべきではありません。 脳への相対的なボックスの位置を調整するためにクリックして、選択された部分をドラッグします。 ボックスの中央に脳を置きます。ボックス内に十分な深部脳がしっかりと把持するPostionが、あまりにも深くない適切な配置を防ぐオーバーハングを作成します。 配置されると、脳ボックスの輪郭がオーバーハングについて試験することができます。 Box_CutoutとSmoothed_Edited_Brain_Modelを選択します 。ブール演算を選択します。 赤いそれを回すためにSmoothed_Edited_Brain_Modelをクリックします。 ブール減算を選択して、計算を適用。 安全ボックス内に配置されることから脳組織を妨げるオーバーハングのための脳のチェックボックスをオンにします。これらのオーバーハングが存在する場合、それはボックス内の以下の深さであるので、脳を調整します。脳は、所望の深さとオーバーハングにある場合存在している、オーバーハングを除去するためのソリューションのための補助的なセクション10を参照してください。 Blade_Gapsモデルを選択します。右クリックし、[移動]を選択します。位置Z値を記録し、その後、ウィンドウを閉じます。これは、ほとんどの後方ブレードギャップの位置になります。 脳スライサーパーツから来たブレード STLを選択します。右クリックし、[移動]を選択します。 絶対翻訳を選択します。 7.8からZ値を入力します。 XとYの値については、現在の位置パラメーターボックスから対応する値を入力してください ブレード STLを選択します。右クリックし、[複製]をクリックします。 部品を配置し確認してください。合計数のブレードの合計数を入力します。 Zカウントボックスに同じ番号を入力します。 Zのギャップにスラブ厚を入力します。重複をクリックします。スラブ厚を変化させた場合には、ブレードが個別に配置される必要があります。 （前方に後方からの移動）は、前からそれぞれの新しいブレードを複製そのセクションのセクションの厚さに等しいzのギャップを有します。 ミクロトーム刃のためのステップ7.9と7.10を繰り返して、スライサー内のブレードとまったく同じ間隔でミクロトームブレード部品を配置します。人間の脳：このステップをスキップします。 Blade_Holder_Main部分と一緒にミクロトームブレードを選択し、ブール演算を選択します。 赤、それらを強調するためにミクロトームブレード内のすべてのブレードを選択します。ブール減算をクリックして、計算を適用。 修復モードを選択します。拡張修復を実行します。修理を適用選択し、古い部分を削除します。 一部のブレードホルダーの名前を変更します。 STLなどの一部をエクスポートします。 Shiftキーを押しながら選択Smoothed_Edited_Brain_Model、前のステップで作成したブレードモデル 、およびサブとメインのすべてを。ブーリアン演算をクリックします。 それ自体によってメイン赤以外の部品のすべてを作りますそれらをlectingと赤に移動するには、緑色のボックスの下矢印をクリック。 ブール減算を選択し、計算を適用]を選択します。 修復モードをクリックします。修復モードでは： オーバーハングや鋭いポイントのチェックボックスをオンにします。これらはNetfabbまたはMeshmixerで平滑化することができます。 自動修復、拡張、修復をクリックします。その後、修復を適用し、古い部分を削除右側の修理脳ボックスをクリックして、 脳スライサーボックスに名前を変更します。 STLとしてエクスポート。 8. Ultimaker 2に脳スライサーボックスを印刷マーモセットの脳：クーラクーラに脳スライサーボックスをインポートします。 [回転]を選択し、それがベッドの上に平らになるようにボックスを回転させるために円をドラッグします。 0.1ミリメートル層の解像度、50％充填密度、ラフト：印刷設定を調整します。 SDカードに保存するツールパスを選択します。 （〜12時間の時間を表示します。） インポートブレードホルダーでクーラへとスロットが側にあると六角面がXZまたはYZ平面内にあるので、それを回転させます。 オブジェクトを複製します。 0.2ミリメートル層の解像度、20％充填密度、つば：印刷設定を調整します。 SDカードに保存するツールパスを選択します。 （印刷時間〜3時間） 人間の脳：クーラクーラに脳スライサーボックスをインポートして、8.1.2のように回転させます。 印刷設定を調整します：0.2ミリメートル層の解像度30〜35％の充填密度、いかだを。 SDカードに保存するツールパスを選択します。 （単一半球ボックスの〜70時間の時間を表示します。） Ultimaker 2オンプレートを構築するためにスティックのり接着剤の薄層を適用します。 SDカードを挿入します。印刷を選択して、パーツを選択します。 9.脳を切断マーモセットの脳固定脳、脳スライサー、2ブレードホルダー、ミクロトーム刃、フッ素系オイルの1ミリリットル、fにワークステーションを準備緯度ピンセット、保護手袋、および包埋カセット。 ブレードホルダー上のスロットに新しいミクロトームの刃を配置します。各ブレードの斜めの縁が同じ方向に向いていることを確認します。 ミクロトームブレードを取り扱う際は保護手袋を着用します。 ホルマリンから脳を外し、静かに乾燥させます。 スライサーに脳を置きます。フッ素オイル数滴の容易な位置決めを可能にするために、脳およびスライサーにも適用することができます。脳が所定の位置にしっかりとあることを確認します。 対応するブレードスロット内のブレードとブレードホルダーを置きます。 ブレードホルダーにしっかりと下に押して、脳を切断するために、低速バランス圧力を加えます。 脳の前面から始めて、各スラブを1つずつ削除します。これは、スラブ自体を削除する前に、スラブの前にミクロトームの刃を除去するのに役立ちます。各スラブの前方/後方向きに細心の注意を払ってください。 前方ANの写真を撮ります各スラブのd後面。後部スラブは、最も可能性の高い別々の部品が含まれているので、埋め込むためのピースの向きに注意を払うだろう。包埋カセットに各スラブを配置し、10％ホルマリン溶液にそれらすべてを置きます。 人間の脳慎重に箱に脳の適合をテストします。 ゆっくりと、しかししっかりとスライスし、角度の付いたカットを使用して、一方の端部から始まる脳をスライス。各ブレードの隙間を通って脳をカットします。 各スラブの数と、前方/後方の方向に細心の注意を払って、一度に各スラブ1を削除してください。 各スラブの前面と後面の写真を撮ります。密封された10％ホルマリン袋にスラブを配置します。組織ブロックは、スラブから切り出し、埋め込みカセット内に配置されます。 ブレインボックス（補足節）10.取り外しオーバーハング Meshmixer：スライスを引き出します Smoothed_Editをインポートed_Brain_Model。 [編集]を選択し、スライスを作成します。メイクスライスで： 積み上げ3D、Zを選択して1〜2ミリの厚さを入力します。計算をクリックします。スライスをロードすると、[Accept]をクリックします。 皮質の下の方に大きな周囲長との1または2のスライスを選択します。これらのスライスは、 サブボックスのレベルより下でなければなりません。 Brain_Slice_＃などこれらのスライスのそれぞれをエクスポートします。 オーバーハングを除去するために、スライスを拡張：Netfabbプロフェッショナル Brain_Slice_の＃スライスをインポートします。 各Brain_Slice_＃を （チェックすると部品の手配をオフに）重複しています。 右各Brain_Slice_＃と選択スケールの一つのコピーをクリックします。 チェックを外して固定スケーリング比。それがサブボックスの下部のレベルに到達するようそしてY方向に脳スライスをスケールアップ。 Brain_Slice_Big_＃これらのスライスの名前を変更します。 Y位置Oをチェック部分を右クリックして、元のBrain_Slice_の＃fおよび移動を選択します。元Brain_Slice_の＃スライスのそれぞれについて、Y位置を記録します。 計算を実行します。Brain_Slice_＃[y位置] – （Brain_Slice_Big_＃[Yサイズ] – Brain_Slice _＃[Yサイズ]） 個別Brain_Slice_Big_＃2のそれぞれを選択し、右クリックして[移動]を選択します。 Y並進パラメータボックスで10.2.6から算出した値を入力します。 XとZ変換パラメータについては、現在の位置パラメーターボックスに位置の値を入力します。絶対翻訳を選択します。翻訳し、ウィンドウを閉じますをクリックします。 注：ボックスを作るときBrain_Slice_Big_の＃スライスは、脳とブレードと一緒に差し引かれます。 追加のスキャンのための11マーモセットの脳MRIクレードル脳MRIクレードルを作成します クロムの上面ことを確認してくださいadleはBox_Cutoutと同じ高さにあります。クレードルに脳の深さと位置は、それがスライサーのためであると同じように設定する必要があります。 Shiftキーを押しながら選択Smoothed_Edited_Brain_Modelとクレードルを選択します。 ブール演算を選択します。ブール減算を選択し、赤いそれを強調するために、脳を選択します。その後、計算を適用。 （該当する場合もBrain_Slice_Big_の＃スライスを選択します。） スライサーのために以前に行ったようにクレードル輪郭に鋭いポイントを削除するには、修復モードを入力します。拡張修復を選択します。修理を適用し、古い部分を削除します。 右部分MRI脳クレードルの名前を変更する]をクリックします。 、STLをエクスポート]を選択します。 クーラ：クレードルを印刷クーラにMRI脳クレードルをインポートし、脳の切り欠きを有する平坦な部分が表向きになるように回転させます。 0.1ミリメートル層の解像度、100％充填密度、ラフト：印刷設定を調整します。 <LI> SDカードに保存するツールパスを選択します。 （印刷時間〜10時間） 8.3で説明したようにUltimaker 2に印刷します。 クレードルを使用して取得した高解像度T2 * MRI ペーパータオルで脳の表面から乾いホルマリン。 スライサーで説明したようにクレードルに脳を置きます。 50ミリリットルの遠心分離管に脳とクレードルをスライドさせます。フッ素系オイルでいっぱいにそれを記入します。 ゆっくりと気泡が脳から逃れることができるようにチューブを絞ります。そこに気泡が生じないようにするために、チューブキャップのはめ込みにキャップを挿入を挿入します 。キャップを固定し、パラフィンでチューブを密封します。 前述のようにコイル状にチューブを置きます。 3D T2 *パラメータを表1に示します。 Mipavで18解剖学的100ミクロンT2 * -重み付け買収を開き、10 回目の買収に登録します。登録パラメータは、1.1.7と同じです。ユタ：登録画像を平均化ilities、画像電卓バルク画像、平均。