一种用于丝状真菌菌落细菌生物膜的定性多尺度分析的新方法利用共聚焦和电子显微镜

1.细菌和真菌培养的制备 真菌培养的制备 制备玻璃纸膜具有相同的直径的培养皿中并煮沸在EDTA中（1克/升用去离子水）30分钟。用去离子水冲洗的床单和高压灭菌他们两次。 接种真菌琼脂制备的真菌预培养插头覆盖用EDTA预处理玻璃纸膜的适当的琼脂培养基上。孵育它在最佳生长温度以获得菌落直径约1厘米。 为L.双色 S238N，孵育在25℃下5天Pachlewski P5琼脂培养基上，制成0.5克diNH4酒石酸，1克KH 2 PO 4，0.5g的MgSO 4上的·7H 2 O，5克麦芽糖的D + 20克葡萄糖D +的1毫升10％盐酸硫胺素，将1ml的1/10稀释微量营养素溶液（6克/升硫酸亚铁0.27克/升钼trioxyde; 8.45克/升硼酸5克/大号男人ganese硫酸盐; 5g / L的硫酸铜; 2.27克/升的硫酸锌）补足至1升去离子水;和20g琼脂; pH值5.5。 从真菌预培养，接种覆盖有含有低碳琼脂培养基促进集落的径向膨胀的EDTA预处理玻璃纸膜新琼脂平板上。 接种的培养皿，轻轻刮擦外部区域（其中细胞具有相同的生理状态）从预培养用手术刀真菌菌落和菌丝转移到新的琼脂平板上。 在最佳生长温度孵育，直到新的菌落的直径为约1厘米。对于二色补血草 S238N，培养他们在25℃，P20琼脂培养基（0.25克亭4酒石酸盐5天;0.5克KH 2 PO 4;0.25克硫酸镁4·7H 2 O的1克葡萄糖D +的0.5含10％盐酸硫胺素的0.5毫升1/10稀释微量营养素溶液（比照1.1.2。1）中，由向1升去离子水;和20g琼脂; pH值5.5）。 注：由于对玻璃纸预培养，第二个文化将不包含在中央插头琼脂培养基。琼脂塞应为生物膜的进一步分析被移除，因为这些插头引入琼脂和可以创建在分析偏差营养素。这一步骤只涉及真菌即保持和传播在琼脂平板上，并且这是没有必要对于从孢子或冷冻储存传播真菌物种。 细菌培养物的制备 用无菌环以收集从培养2至3个单独的细菌菌落的适当的琼脂培养基上并接种25毫升液体的Luria-BERTANI（LB）培养基（或任何其它适当的介质中，根据所用的菌株）。对于荧光假单胞菌 BBc6，在28℃轻轻摇动（〜150rpm）下孵育过夜培养。 注意：使用应变具有标记荧光蛋白，如绿色荧光蛋白，是优选的，因为这避免了前显微观察进行双重染色（真菌和细菌）。定时，搅拌速度，和孵育的温度取决于所用的菌株，其目标是获得在后期指数增长的培养。 2.对真菌菌落制备N 体外生物膜细菌离心机在5000×g离心3分钟的细菌培养和悬浮颗粒在25ml无菌0.1M磷酸钾缓冲液（25克/升KH 2 PO 4 2.78克/ LK 2 HPO 4，pH值5.8）的。重复此步骤一次，并调整最终细菌浓度到用相同缓冲液10 9细胞/ ml。 填充6孔微量用5ml细菌悬浮液（或用于阴性对照的无菌的0.1M磷酸钾缓冲液）的。 切烽的玻璃纸薄膜人文化用无菌刀片获得玻璃纸广场上每个膜单真菌菌落。小心地取出使用镊子从固体培养基含有菌丝玻璃纸正方形和含有玻璃纸菌丝的平方转移到含有细菌悬浮液的微板的孔中。 轻轻摇动微孔板，而真菌菌落仍然附着于玻璃纸;那么，除去玻璃纸，留在板上的真菌菌落。 孵育在适于所研究微生物的温度下温和搅拌（〜60转）微孔板。 注意：温育时间取决于建立生物膜和阶段的速度进行分析。对于荧光假单胞菌 BBc6 / L。双色，孵育在20℃下30分钟以获得早期生物膜和多达16个小时以获得成熟生物膜。 3.生物膜格式的激光扫描共聚焦显微镜分析离子 样品制备 以除去浮游的细菌和细菌静电附着到菌丝，通过将其转移到填充用5ml强烈盐溶液（氯化钠，17克/升）17的一个新的6孔微冲洗真菌;轻轻摇动1分钟。 转移真菌含有5ml无菌0.1M磷酸钾缓冲液的新6孔微板，2分钟轻轻摇动，和真菌转移到新鲜的磷酸钾缓冲液中。 切真菌菌落的一部分用手术刀，同时保持它在磷酸钾缓冲液，使得所获得的部分包含有关真菌菌落的一半进行成像。 染色样品，将其转移到培养皿中填充有含有适当的荧光染料（取决于分析的目的）无菌水，并在黑暗中孵育它。 为了显现真菌网络，使用，例如，刚果红（0.1％最终共ncentration，5分钟温育），小麦胚芽凝集素（WGA）凝集素缀合的Alexa Fluor 633（10微克/毫升的最终浓度，孵育10分钟）或FUN1（10μM终浓度，孵育10分钟）。 如果使用非荧光标记细菌，染液的细菌细胞与市售的许多细胞穿透物的DNA的染料中的特定DNA的荧光探针。例如，使用DAPI（0.25微克/毫升的最终浓度，孵育10分钟）。 以可视化的基质蛋白，用蛋白质污渍21。 染色后，通过将其转移到含有10毫升无菌磷酸盐的0.1M钾的培养皿盖子冲洗样品和1分钟轻轻摇动。 一半浸没在培养皿盖的滑动和微妙使切割部分浮在载玻片上方。然后，慢慢地取出从缓冲溶液中的滑动，使样品在幻灯片上轻轻沉降。 <br />注意：对于这一步，就轻轻地进行，以避免干扰生物膜非常重要。 最后，添加10微升抗褪色封固剂的样品中，用玻璃盖玻片覆盖。 注意：一旦滑动制备，必须尽快进行显微分析（至多30分钟内），以避免在生物膜结构修饰。 共聚焦显微镜分析 检查具有耦合到成像软件10倍或40倍物镜的共聚焦激光显微镜下的幻灯片。 注意：在此，一个多光束扫描共聚焦显微镜配备405，488和561 nm激发激光器，一个的GaAsP PMT检测，和10X 0.3 NA和40X 1.2 NA目标使用。 使用适于所请求的数据的类型和时间约束参数来执行成像。根据所使用的染色剂和制造商的recommendati使用激光激发/发射波长附件。使用扫描瓷砖和Z堆栈功能的组合，以获得真菌菌落和生物膜的全球3D视图。 注意：使用下列参数被收购于图3图片：8位/像素，平均= 2，像素停留= 1.58微秒，地砖用扫描拼接在线（10％的覆盖率，阈值= 0.7）5×5的图像; Z-步骤= 2微米。 对于3D数据可视化，可以使用许多免费或商业软件（这些提供3D渲染许多选项）中的一个。 例如，要显示Z堆叠的数据作为二维最大强度投影，减亮场通道，调整亮度和对比度，并合并通道以创建合成图像。如果它们存在，消除片而不会在Z堆叠四肢信号。然后，执行一个二维最大强度投影和转换结果存入RGB颜色。使用的“Z项目”功能中的ImageJ软件22获取图像P通过二维最大强度的预测这​​里不满。 4.电子显微镜分析制备如在步骤3.1.2 LSCM描述的，除了样品，漂洗步骤后生物膜转移到无菌水代替磷酸钾缓冲液。这避免了盐晶体在脱水步骤中，这会扰乱SEM成像的形成。 转移生物膜到样品保持器和除去过量的水;只允许少量水防护膜，以覆盖样品。 将样品转移到一个可变压力扫描电子显微镜（VP-SEM）的腔室;它冻至-50°在珀尔帖冷却阶段℃;并允许它慢慢冷冻干燥，直接在SEM室中，以100帕15小时设定可变压力。 冷冻干燥结束后，检索样品并将其转移到一个高真空成膜装置。大衣platinu 2纳米样品米氩等离子体（2.5×10 -2毫巴，35个mA）的下（石英测量）。 观察用SEM涂覆样品装有使用“镜头”高分辨率检测器和1千伏的电子高张力场发射枪（FEG）。