Зика Вирус Система Инфекционный Культура клеток и<em> In Vitro</em> Профилактический эффект интерферонов
Summary
Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.
Abstract
Зика Вирус (ZIKV) является новым патогеном, который связан с отклонениями в развитии плода, таких как микроцефалия, дефектами глаз, и ослабленный рост. ZIKV является РНК – вирусом из семейства Flaviviridae. ZIKV в основном передается комарами, но также может быть распространен материнской плода вертикальной передачи, а также сексуального контакта. На сегодняшний день не существует надежных лечения или вакцины варианты, доступные для защиты лиц, инфицированных вирусом. Развитие воспроизводимым, эффективного вируса Зика системы инфекционного культивирования клеток имеет решающее значение для изучения молекулярных механизмов репликации ZIKV, а также разработки лекарственных средств и вакцин. В связи с этим, протокол описания клеток на основе в пробирке Zika системы культуры млекопитающих от вирусов для вирусного роста производства и анализа сообщается здесь. Более подробная информация о формировании бляшек вирусом Зика на монослой клеток и анализа бляшек для измерения вирусного титра представлены. Кинетика репликации вирусного геномаи replicatory промежуточные двухцепочечной РНК генома определяются. Эта культура платформа была использована для экрана с библиотекой небольшого набора цитокинов, в результате идентификации интерферона-альфа (IFN-a), ИФН-β и IFN-γ в качестве сильнодействующих ингибиторов Зика вирусного роста. Таким образом, инфекционный Зика вирусная система в пробирке культура и различные вирусологические анализы показано в этом исследовании, у которого есть потенциал , чтобы большую пользу научному сообществу в выяснении дальнейшем механизмы вирусного патогенеза и эволюцию вирусной вирулентности. Противовирусные IFN-альфа может быть дополнительно оценена в качестве профилактического, постэкспозиционная профилактического и вариант лечения для Зика вирусных инфекций в группах высокого риска, в том числе инфицированных беременных женщин.
Introduction
Зика Вирус (ZIKV) является важным патогеном человека , связанный с микроцефалия и бедными беременности исходы 1,4. ZIKV принадлежит множеству соответствующих медицинской точки зрения флавивирусов, которые могут вызвать неврологические дефекты, такие как лихорадка денге, Западного Нила и вируса энцефалита Сент-Луис. Основной способ передачи вируса является москита вектора комар жёлтолихорадочный, и, кроме того, передача инфекции половым путем также сообщалось 5,6. ZIKV стала одним из основных глобальной проблемой здравоохранения из-за расширения географического распределения вектора комара и его сильной корреляции с врожденными дефектами. ZIKV был впервые выделен в 1947 году из дозорного макаки – резуса в лесу Зика, Уганда и первый случай заболевания человека был зарегистрирован в 1952 году 7,8. Лица, которые становятся зараженными ZIKV настоящего с умеренными симптомами, такими как лихорадка, сыпь, головная боль, конъюнктивит и мышцы / боли в суставах. Инфицированные беременные женщины могут передавать ZIKV для развивающегося плода 1. ZIKV инфекция также связана с синдромом Гийена-Барре, периферического нерва аутоиммунной демиелинизации расстройства 9.
Вирусный геном Зика состоит из положительном смысле, одноцепочечной молекулы РНК, которая составляет около 10,8 тысяч пар нуклеотидов в длину. Структура генома организована 5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR с некодирующие областей (NCR), фланкирующих область белоккодирующей 6. Один полипротеина (3419 аа) переводится именно со- и посттрансляционно расщепляется на 10 небольших пептидов. Оба 5'NCR и структуры стволовых петля 3'NCR РНК играют решающую роль в начале вирусного генома трансляции и репликации. Структурные компоненты генома состоят из капсида, мембран и белков оболочки. Неструктурные белки имеют решающее значение для репликации генома.
В настоящее время вирусные штаммы Zika сгруппированы в три основных генотипов: Западной Африки, Восточной Африки и Азии 6,10-13. Было высказано предположение , что восточноафриканское родословная распространилась на Западной Африке и Азии, где впоследствии дальнейшее развитие 12. Азиатский генотип несет ответственность за нынешние вспышки в Северной и Южной Америке. Вирус Зика может культивироваться в обоих комара и в клетках млекопитающих. Первичные фибробласты кожи, незрелые дендритные клетки, корковые нервные клетки – предшественники и клетки Vero чувствительны к Зика вирусной инфекции 10,14,15. Интерфероны обоих типов I и II типа , как было показано , чтобы ограничить рост ZIKV в кожных фибробластов 15. Целями данного исследования являются обеспечение поэтапного, подробный протокол для производства и опробования азиатских генотипа Zika вирусного штамма PRVABC59 в в системе культивирования клеток млекопитающих и продемонстрировать полезность этой инфекционной системы культуры в качестве платформы разработки лекарственных средств. Этот ресурс имеет потенциал, чтобы в значительной мере способствовать Zika вирусные и неврологическое научное сообщество дальнейшее выявление IТ.С. механизмы вирусного патогенеза и эволюции вирусной вирулентности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь, обтекаемый протокол для культивирования вируса Зика в пробирке представлена. Критические шаги в том числе, определение оптимальных конечных точек для расширения вирусной культуры, измерения титра, и количественной оценки репликации генома были предоставлены. Вирус Зика я…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
References
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro – Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
- Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), 59-62 (2015).
- Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
- Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
- Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
- Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome–case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
- Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
- Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
- Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
- Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
- Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
- Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).
