Summary

Virus Zika sistema de cultura celular Infecciosas e do<em> In Vitro</em> Efeito profilático de interferões

Published: August 23, 2016
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Summary

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Abstract

Vírus Zika (ZIKV) é um agente patogénico emergente que está ligada a anomalias do desenvolvimento fetal, tais como microcefalia, defeitos oculares, e comprometimento do crescimento. ZIKV é um vírus de RNA da família Flaviviridae. ZIKV é transmitido principalmente por mosquitos, mas também pode ser transmitida por maternal à transmissão vertical fetal, bem como o contato sexual. Até à data, não há nenhum tratamento ou vacinas fiáveis ​​opções disponíveis para proteger as pessoas infectadas pelo vírus. O desenvolvimento de um sistema de cultura de células reprodutível, eficaz Zika vírus infeccioso é fundamental para o estudo dos mecanismos moleculares de replicação ZIKV, bem como o desenvolvimento de drogas e vacinas. A este respeito, um protocolo descrevendo um in vitro Zika sistema de cultura de mamífero com base em células de vírus para análise da produção e crescimento virai é aqui relatado. Os detalhes sobre a formação de placas de vírus Zika numa monocamada de células e ensaio de placa para medição título virai são apresentados. cinética de replicação do genoma virale intermediários replicatory de cadeia dupla do genoma de ARN são determinadas. Esta plataforma de cultura foi utilizado para a tela de encontro a uma biblioteca de um pequeno conjunto de citocinas, resultando na identificação de interferão-α (IFN-α), IFN-β e IFN-γ como potentes inibidores do crescimento virai Zika. Em resumo, um sistema in vitro infecciosa viral Zika cultura e vários ensaios virológicos são demonstrados neste estudo, que tem o potencial de se beneficiar muito a comunidade de investigação para elucidar ainda mais os mecanismos de patogénese viral e a evolução da virulência do vírus. Antiviral IFN-alpha pode ainda ser avaliada como um, profilático pós-exposição, e opção de tratamento profilático para infecções por vírus Zika em populações de alto risco, incluindo mulheres grávidas infectadas.

Introduction

Virus Zika (ZIKV) é um patógeno humano importante associado à microcefalia e pobres resultados perinatais 1,4. ZIKV pertence ao conjunto de flavivírus clinicamente relevantes que podem causar defeitos neurológicos, tais como o dengue, Nilo Ocidental, e vírus da encefalite de St. Louis. O principal modo de transmissão virai é pelo vector mosquito Aedes aegypti, e, além disso, a transmissão sexual também tem sido relatada 5,6. ZIKV tornou-se um grande problema global de saúde devido à distribuição geográfica expansão do mosquito vetor e sua forte correlação com defeitos de nascimento. ZIKV foi isolado pela primeira vez em 1947 a partir de um macaco rhesus sentinela na floresta Zika, Uganda e o primeiro caso humano foi relatado em 1952 7,8. Indivíduos que se tornam infectados com ZIKV apresentam sintomas leves, como febre, erupção cutânea, dor de cabeça, conjuntivite e dor muscular / conjunta. Mulheres grávidas infectadas podem transmitir ZIKV ao feto em desenvolvimento 1. ZInfecção IKV também tem sido associada à síndrome de Guillain-Barre, um nervo periférico desordem auto-imune desmielinização 9.

O genoma viral consiste Zika de sentido positivo, de cadeia simples molécula de RNA que é cerca de 10,8 quilobases de comprimento. A estrutura do genoma está organizado como 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2a-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, com regiões não codificantes (NCR) flanqueando uma região codificadora de proteínas 6. A única poliproteína (3419 aa) é traduzida que é co- e pós-tradução clivada em 10 peptídeos menores. Tanto o 5'NCR e estruturas de haste-laçada 3'NCR RNA desempenham um papel crítico no início do genoma viral tradução e replicação. Os componentes estruturais do genoma são compostas das proteínas da cápside, a membrana, e de envelope. As proteínas não estruturais são essenciais para a replicação do genoma.

Atualmente, estirpes virais Zika são agrupados em três genótipos principais: Oeste Africano, Leste Africano e Asiático 6,10-13. Foi proposto que a linhagem do Leste Africano espalhou para a África Ocidental e Ásia, onde mais tarde evoluiu ainda mais 12. O genótipo asiático é responsável pelos surtos atuais nas Américas. Zika vírus podem ser cultivados em ambos os mosquitos e as células de mamíferos. Fibroblastos dérmicos primários, células dendríticas imaturas, células progenitoras neuronais corticais, células Vero e são susceptíveis a infecções virais Zika 10,14,15. Ambos os tipos I e tipo II interferões têm sido mostrados para restringir o crescimento ZIKV em fibroblastos da pele 15. Os objectivos deste estudo consistem em proporcionar, um protocolo detalhado passo a passo para a produção e o ensaio de genótipo asiática ZIKA estirpe viral PRVABC59 num sistema de cultura de células de mamífero e para demonstrar a utilidade deste sistema de cultura infecciosa como uma plataforma de desenvolvimento de drogas. Este recurso tem o potencial de se beneficiar muito a comunidade de pesquisa viral e neurológica Zika para elucidar ainda mais imecanismos ts da patogénese viral e evolução da virulência do vírus.

Protocol

Nota: Uma representação esquemática do fluxo de trabalho é apresentado na Figura 1. 1. células Utilização de células Vero para a produção de vírus e Zika análise do ciclo de replicação virai. Prepare meio completo de crescimento contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 unidades / ml), e 10 mM de HEPES. Células Vero de cultura com o meio de crescimento com…

Representative Results

Uma estirpe viral Zika (PRVABC59; número de acesso GenBank KU501215) do genótipo asiático foi utilizado neste estudo 12. Células Vero a 80% de confluência foram utilizadas para investigar Novo infecção viral de Zika. Para a produção viral e posterior caracterização virológica, foi empregado um início passagem de vírus (P3) Zika. As placas virais foram observadas no segundo dia da infecção. Progênies virais Zika libertados a partir da célula …

Discussion

Aqui, um protocolo simplificado para a cultura de vírus Zika in vitro é apresentado. As etapas críticas incluindo, identificando pontos finais óptimas para a expansão da cultura de vírus, medindo título, e quantificar a replicação do genoma foram fornecidos. vírus Zika é um patógeno humano, por isso, enquanto manuseamento de agentes infecciosos, procedimentos de biossegurança devem ser rigorosamente seguidas. Uma linha de células de rim de macaco, Vero, foi usado para demonstrar vários ensaios vi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma Life Science D5796
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red   Corning 25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies T10282
Countess – Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific C10227
Countess-cell counting  chamber slides ThermoFisher Scientific C10283
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System Thermo Fischer 4471088
RNase-Free DNase Promega M6101
Vero Cell Line  ATCC CCL-81
Zika viral strain PRVABC59 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6 Peprotech 200-06             
IL-1 alpha        Peprotech 200-01A          
TNF-alpha Peprotech 300-01A          
Interferon alpha A   R & D Systems 11100-1
Interferon beta Peprotech 300-02BC
Interferon gamma Peprotech 300-02
Centrifuge 5415R Eppendorf 5415R
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI Nikon Visit Nikon for Request

References

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro – Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
  4. Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), 59-62 (2015).
  5. Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
  6. Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
  7. Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
  8. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome–case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
  10. Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
  11. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
  12. Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
  13. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
  14. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
  15. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
  16. Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
  17. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  18. Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
  19. Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).

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Cite This Article
Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).

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