Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la<em> In Vitro</em> Effetto profilattico di interferoni
Summary
Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.
Abstract
Zika Virus (ZIKV) è un patogeno emergente che è collegato a anomalie dello sviluppo fetale, come la microcefalia, difetti dell'occhio, e la crescita compromessa. ZIKV è un virus a RNA della famiglia Flaviviridae. ZIKV è trasmesso principalmente dalle zanzare, ma può anche essere diffuso da materna a trasmissione verticale del feto, così come il contatto sessuale. Fino ad oggi, non ci sono trattamenti o vaccini opzioni affidabili per proteggere quelli infettati dal virus. Lo sviluppo di un sistema di coltura cellulare riproducibile, efficace virus Zika infettiva è critico per studiare i meccanismi molecolari di replicazione ZIKV così come farmaci e vaccini sviluppo. A questo proposito, un protocollo che descrive una in vitro Zika sistema di coltura di cellule di mammifero basata virus per virale analisi produzione e la crescita è riportata qui. Dettagli sulla formazione di placche da virus Zika su un monostrato di cellule e saggio di placca per misurare titolo virale sono presentati. cinetica replica genoma viralee doppio filamento di RNA genomici intermedi replicatory sono determinati. Questa piattaforma coltura è stata utilizzata per lo schermo da una libreria di un piccolo gruppo di citochine conseguente identificazione di interferone-α (IFN-α), IFN-β e IFN-γ come inibitori potenti del Zika crescita virale. In sintesi, un infettiva sistema di coltura in vitro Zika virale e vari saggi virologici sono dimostrati in questo studio, che ha il potenziale per beneficiare notevolmente la comunità di ricerca nel chiarire ulteriormente i meccanismi di patogenesi virale e l'evoluzione della virulenza del virus. Antivirale IFN-alfa può essere ulteriormente valutata come un profilattico, profilattico post-esposizione, e opzione di trattamento per le infezioni da virus Zika in popolazioni ad alto rischio, comprese le donne in gravidanza infettate.
Introduction
Zika Virus (ZIKV) è un importante patogeno umano associato con microcefalia e poveri gravidanza esiti 1,4. ZIKV appartiene alla serie di flavivirus clinicamente rilevanti che possono causare difetti neurologici, come la dengue, West Nile, e virus encefalite di St. Louis. La modalità principale di trasmissione virale è dal vettore zanzara Aedes aegypti, e, inoltre, la trasmissione sessuale è stata riportata anche 5,6. ZIKV è diventata un importante problema di salute globale a causa della espansione della distribuzione geografica della zanzara vettore e la sua forte correlazione con difetti alla nascita. ZIKV è stato isolato nel 1947 da una scimmia Rhesus sentinella nel bosco Zika, l'Uganda e il primo caso umano è stato segnalato nel 1952 7,8. Gli individui che si infettano con ZIKV presente con sintomi lievi come febbre, eruzioni cutanee, mal di testa, congiuntivite, dolori muscolari e / articolare. Le donne in gravidanza infettate possono trasmettere ZIKV al feto in via di sviluppo 1. ZInfezione IKV è stata anche legata alla sindrome di Guillain-Barre, un nervo periferico demielinizzazione autoimmune disturbo 9.
Il genoma virale Zika consiste in un senso positivo, molecola a singolo filamento di RNA che è di circa 10,8 chilobasi di lunghezza. La struttura del genoma è organizzato come 5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, con le regioni non codificanti (NCR) che fiancheggia una regione codificante 6. Una singola poliproteico (3.419 bis) è tradotto cioè co- e post-traduzionali spaccati in 10 piccoli peptidi. Sia il 5'NCR e strutture stem-loop 3'NCR RNA svolgono un ruolo critico nella inizio della traduzione del genoma virale e la replica. I componenti strutturali del genoma sono costituiti da proteine capside, membrana, e la busta. Le proteine non strutturali sono fondamentali per replicazione del genoma.
Attualmente, i ceppi virali Zika sono raggruppati in tre genotipi principali: West African, Dell'Africa orientale e asiatico 6,10-13. E 'stato proposto che l'Oriente lignaggio africano diffuso in Africa occidentale e in Asia, dove poi ulteriormente evoluto 12. Il genotipo asiatico è responsabile per le epidemie in corso in America. virus Zika può essere coltivato sia in zanzare e cellule di mammifero. Fibroblasti dermici primarie, cellule dendritiche immature, cellule progenitrici neurali corticali, e le cellule Vero sono suscettibili alle infezioni virali Zika 10,14,15. Sia di tipo I e tipo II interferoni hanno dimostrato di limitare la crescita ZIKV nei fibroblasti cutanei 15. Gli obiettivi di questo studio sono quelli di fornire un graduale, protocollo dettagliato per la produzione e il saggio del genotipo asiatico ZIKA ceppo virale PRVABC59 in un sistema di coltura cellulare di mammifero e per dimostrare l'utilità di questo sistema di coltura infettiva come piattaforma di sviluppo di droga. Questa risorsa ha il potenziale per beneficiare notevolmente la comunità di ricerca virale e neurologica Zika di chiarire ulteriormente imeccanismi di patogenesi ts virale e l'evoluzione della virulenza del virus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, un protocollo semplificato per la coltura dei virus Zika in vitro è presentato. Passaggi critici tra cui, individuando punti finali ottimali per espandere la cultura del virus, la misurazione titolo, e quantificare replicazione del genoma sono stati forniti. virus Zika è un patogeno umano, così, durante la manipolazione di agenti infettivi, le procedure di biosicurezza devono essere seguite scrupolosamente. Una linea cellulare di rene di scimmia, Vero, è stato utilizzato per dimostrare vari saggi virol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
References
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