מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em> במבחנה</em> אפקט מניעתי של אינטרפרונים
Summary
Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.
Abstract
וירוס הזיקה (ZIKV) הוא פתוגן מתעוררים מקושר ליקויים התפתחותיים בעובר כגון מיקרוצפליה, פגמי עין, וצמיחה לקויה. ZIKV הוא וירוס RNA של המשפחה Flaviviridae. ZIKV מועבר בעיקר על ידי יתושים, אבל יכול גם להיות מופץ על ידי אימהי העברה אנכית עוברת וכן מגע מיני. נכון להיום, לא קיימות אופציות טיפול או חיסון אמין זמינות להגן על אלה שהנגיף יחדור. פיתוח מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס לשחזור, יעיל Zika הוא קריטי לחקר המנגנונים המולקולריים של שכפול ZIKV וכן פיתוח תרופות חיסון. בהקשר זה, פרוטוקול המתאר מערכת התרבות יונקים מבוססי תאים במבחנה Zika וירוס לניתוח בייצור ובצמיחה ויראלי מדווח כאן. פרטים על היווצרות הפלאק על ידי וירוס Zika על monolayer תא ורובד assay למדידת כייל הנגיף מוצגים. קינטיקה שכפול הגנום ויראליביניים replicatory הגנום RNA פעמיים תקועים נחושים. פלטפורמה תרבות זו נוצלה למסך נגד ספריה של קבוצה קטנה של ציטוקינים וכתוצאה מכך לזיהוי-α אינטרפרון (IFN-α), IFN-β ו- IFN-γ כמו מעכבים חזקים של גדילת ויראלי Zika. לסיכום, במבחנת מערכת תרבות ויראלית מדבקת Zika מבחני virological שונים הם הפגינו במחקר זה, אשר יש לו את הפוטנציאל למען קהילת המחקר מאוד הבהרה נוספת המנגנונים בפתוגנזה ויראלי ואת האבולוציה של ארסיות ויראלי. אנטי IFN-alpha ניתן להעריך עוד יותר כאמצעי מניעה מניעתי, שלאחר החשיפה, אפשרות טיפול עבור נגיף Zika באוכלוסיות בסיכון גבוה, כולל בנשים הרות שנדבקו במחלה.
Introduction
וירוס הזיקה (ZIKV) הוא פתוגן אדם חשוב הקשורות מיקרוצפליה והריון עניים ותוצאות 1,4. ZIKV שייך הסט של flaviviruses רלוונטי מבחינה רפואית שיכולה לגרום למומים נוירולוגיות כגון דנגי, קדחת הנילוס המערבי, ווירוסים אנצפליטיס בסנט לואיס. המצב העיקרי של שידור ויראלי הוא על ידי וקטור היתוש Aedes aegypti, ובנוסף, העברה מינית גם דווחה 5,6. ZIKV הפך לנושא בריאות הגלובלי גדול בשל ההתפלגות הגיאוגרפית הנרחב של וקטור יתושי הקשר החזק שלה עם מומים מולדים. ZIKV בודד לראשונה בשנת 1947 מקוף רזוס הזקיף ביער Zika, אוגנדה והתיק הראשון של האדם דווחו בשנת 1952 7,8. אנשים כי להידבק ZIKV הנוכחי עם סימפטומים קלים כגון חום, פריחה, כאבי ראש, דלקת הלחמית, ושרירים / כאבי פרקים. אינפקטד נשים בהריון יכולים לשדר ZIKV לעובר המתפתח 1. Zזיהום IKV גם נקשר תסמונת גיאן-בארה, demyelination אוטואימוניות עצבים היקפיים הפרעת 9.
הגנום הויראלי Zika מורכב במובן החיובי, מולקולת רנ"א חד-גדילי שזה בערך 10.8 kilobases באורך. מבנה הגנום מאורגן כמו 5'NCR-C-PRM-E-ns1-NS2A-NS2B-ns3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, עם אזורים קידוד אי (NCR) איגוף אזור המקודדים חלבונים 6. Polyprotein יחיד (3419 אא) מתורגם כי הוא שיתוף ופוסט translationally ביקע ל -10 פפטידים קטנים. הן 5'NCR ומבני לולאת גזע 3'NCR RNA לשחק תפקיד קריטי תחילתו של תרגום הגנום נגיפי ושכפול. הרכיבים המבניים של הגנום מורכבים של קפסיד, קרום, וחלבוני מעטפה. החלבונים הלא המבניים הם קריטיים עבור שכפול הגנום.
נכון לעכשיו, זני הנגיפים Zika מקובצים לשלוש גנוטיפים עיקריים: אפריקה המערביתבמזרח, אפריקה, ואסיה 6,10-13. הוצע כי שושלת מזרח אפריקה התפשטה במערב אפריקה ואסיה, שם הוא מאוחר יותר התפתח 12. הגנוטיפ אסיה אחראי ההתפרצויות הנוכחיות ביבשת אמריקה. וירוס הזיקה יכול להיות מתורבת בשני יתושים בתאי יונקים. פיברובלסטים עורי ראשיים, תאים דנדריטים בשלים, ובתאים עצביים בקליפת המוח, ותאי Vero חשופים לסכנת הדבקה ויראלית Zika 10,14,15. סוג I וסוג שני II אינטרפרונים הוכחו להגביל את שיעור הגידול ZIKV ב fibroblasts העור 15. המטרות של מחקר זה הן לספק פרוטוקול צעד חכם, מפורט לייצור assaying של PRVABC59 זן ויראלי Zika גנוטיפ אסיאתית מערכת תרבית תאים יונקת וכדי להדגים את התועלת של מערכת התרבות זיהומיות זו כפלטפורמה לפיתוח תרופות. משאב זה הוא בעל פוטנציאל תועלת רב קהילת המחקר ויראלי ונוירולוגיות Zika להבהיר עוד iמנגנוני ts של בפתוגנזה ואבולוציה ויראלי של ארסיות ויראלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, פרוטוקול יעיל עבור culturing וירוס Zika במבחנה מוצג. צעדים קריטיים כולל, זיהוי נקודות קצה אופטימלית עבור בהרחבת התרבות הנגיף, מדידת כייל, וכימות שכפול הגנום נמסרו. וירוס Zika הוא פתוגן אנושי, כל כך, תוך טיפול חומרים מזהמים, נהלי בטיחות ביולוגיים הם להיות אחריו בקפדנו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
References
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro – Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
- Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), 59-62 (2015).
- Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
- Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
- Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
- Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome–case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
- Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
- Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
- Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
- Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
- Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
- Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).
