زيكا الفيروسات نظام المعدية خلية الثقافة و<em> في المختبر</em> وقائية تأثير الانترفيرونات
Summary
Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.
Abstract
زيكا فيروس (ZIKV) هو الممرض الناشئة التي يرتبط تشوهات النمو الجنين مثل صغر الرأس، وعيوب العين، وإعاقة النمو. ZIKV هو فيروس RNA من عائلة الفيروسات المصفرة. ينتقل ZIKV أساسا عن طريق البعوض، ولكن يمكن أيضا أن ينتشر عن طريق الأم إلى الجنين انتقال العدوى فضلا عن الاتصال الجنسي. حتى الآن، هناك أي علاج أو لقاح خيارات الموثوقة المتاحة لحماية المصابين بالفيروس. تطوير نظام استنساخه وفعال زيكا الفيروسات المعدية زراعة الخلايا أمر بالغ الأهمية لدراسة الآليات الجزيئية من تكرار ZIKV وكذلك الأدوية واللقاحات التنمية. وفي هذا الصدد، يتم الإبلاغ عن بروتوكول يصف في المختبر زيكا نظام الثدييات خلية القاعدة ثقافة الفيروس لتحليل الإنتاج والنمو الفيروسي هنا. يتم عرض تفاصيل عن تشكيل لويحات فيروس زيكا على أحادي الطبقة الخلية وفحص اللوحة لقياس عيار الفيروسية. حركية تكرار الجينوم الفيروسيويتم تحديد المزدوج تقطعت بهم السبل وسيطة replicatory RNA الجينوم. وقد استخدمت هذه المنصة الثقافة إلى الشاشة ضد مكتبة من مجموعة صغيرة من السيتوكينات مما أدى إلى تحديد الإنترفيرون α (IFN-α)، IFN-β وIFN-γ باسم مثبطات قوية من النمو الفيروسي زيكا. وخلاصة القول إن أظهرت وجود نظام في المختبر المعدية زيكا الفيروسي الثقافة ومختلف فحوصات الفيروسية في هذه الدراسة، والتي لديها القدرة على الاستفادة بشكل كبير من الأوساط البحثية في توضيح مزيد من الآليات المرضية الفيروسية وتطور الفوعة الفيروسية. فيروسات الإنترفيرون ألفا يمكن إجراء مزيد من التقييم باعتباره، بعد التعرض للقائي، وخيار العلاج الوقائي للعدوى فيروس زيكا في السكان المعرضة للخطر، بما في ذلك النساء الحوامل المصابات.
Introduction
زيكا فيروس (ZIKV) هو الممرض البشري المهم المرتبط صغر الرأس وضعف الحمل أدائهن 1،4. ZIKV ينتمي إلى مجموعة من flaviviruses ذات الصلة طبيا يمكن أن يسبب تشوهات عصبية مثل حمى الضنك وغرب النيل، والفيروسات التهاب الدماغ سانت لويس. الوسيلة الرئيسية لانتقال الفيروس هو من البعوض الناقل الزاعجة المصرية، وبالإضافة إلى ذلك، كما تم الإبلاغ عن الأمراض المنقولة جنسيا 5،6. أصبح ZIKV مشكلة صحية عالمية رئيسية بسبب التوزيع الجغرافي التوسع من البعوض الناقل للمرض وعلاقة قوية مع تشوهات خلقية. تم عزل ZIKV أولا في عام 1947 من قرد هندي صغير خفيرا في الغابة زيكا، أفيد أوغندا وأول حالة بشرية في عام 1952 7،8. الأفراد الذين يصابون بعدوى ZIKV الحاضر مع أعراض خفيفة مثل الحمى والطفح الجلدي، والصداع، والتهاب الملتحمة، والعضلات / آلام المفاصل. النساء الحوامل المصابات يمكن أن تنقل ZIKV إلى الجنين 1. Zكما تم ربط الإصابة IKV لمتلازمة غيلان باريه، والأعصاب الطرفية اضطراب المناعة الذاتية إزالة الميالين 9.
يتكون الجينوم الفيروسي زيكا من الشعور الإيجابي، جزيء RNA واحد الذين تقطعت بهم السبل وهي عبارة عن 10.8 kilobases في الطول. ويتم تنظيم بنية الجينوم كما 5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR، مع المناطق غير المشفرة (NCR) المرافقة منطقة ترميز البروتين 6. وترجم polyprotein واحد (3419 أأ) التي هي المشارك والمشقوق بعد translationally إلى 10 الببتيدات الصغيرة. كل من 5'NCR و3'NCR RNA الهياكل الجذعية حلقة تلعب دورا حاسما في بدء الجينوم ترجمة الفيروسية والتكرار. وتتألف المكونات الهيكلية للجينوم البروتينات قفيصة، غشاء، والمغلف. البروتينات غير الهيكلية حاسمة للنسخ المتماثل الجينوم.
حاليا، يتم تجميع زيكا السلالات الفيروسية إلى ثلاثة أنماط جينية رئيسية هي: غرب أفريقيا، شرق أفريقيا، وآسيا 6،10-13. وقد اقترح أن النسب شرق أفريقيا امتدت إلى غرب أفريقيا وآسيا، حيث أنه في وقت لاحق مزيد من تطور 12. وراثى الآسيوي هو المسؤول عن تفشي الحالية في الأمريكتين. زيكا الفيروس يمكن أن يكون مثقف في كل من البعوض وخلايا الثدييات. الخلايا الليفية الأولية عن طريق الجلد، والخلايا الجذعية غير الناضجة، والخلايا العصبية السلف القشرية، وخلايا فيرو عرضة للزيكا عدوى فيروسية 10،14،15. وقد أظهرت كل من النوع الأول والنوع الثاني إنترفيرون لتقييد نمو ZIKV في الخلايا الليفية الجلد 15. أهداف هذه الدراسة إلى تقديم، بروتوكول تدريجي مفصل لإنتاج ويعاير من النمط الجيني الآسيوية ZIKA السلالة الفيروسية PRVABC59 في نظام زراعة الخلايا الثديية وبيان فائدة هذا النظام الثقافة المعدية كمنصة تطوير العقاقير. هذا المورد لديه القدرة على الاستفادة بشكل كبير من الأوساط البحثية الفيروسي والعصبية زيكا لزيادة توضيح طآليات TS المرضية الفيروسية وتطور الفوعة الفيروسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يتم تقديم بروتوكول مبسط لزراعة فيروس زيكا في المختبر. الخطوات الحاسمة بما في ذلك تحديد نقاط النهاية المثلى لتوسيع ثقافة الفيروسات، قياس عيار، وقياس تكرار الجينوم قدمت. زيكا الفيروس الممرض البشري، لذلك، في حين أن التعامل مع العوامل المعدية، وإجراءات السلا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
References
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro – Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
- Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), 59-62 (2015).
- Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
- Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
- Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
- Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome–case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
- Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
- Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
- Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
- Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
- Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
- Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).
