שימוש במחסנית סינון עבור הסינון של מי דוגמאות הפקת DNA הסביבה
Summary
We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Abstract
Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Introduction
DNA הסביבה (עדנה) בסביבות מימיות מתייחס לחומר גנטי המצוי בעמודת המים. מחקרים שנעשו לאחרונה הדגימו את התועלת של עדנה לאיתור דגים מסביבות מימיים שונים, כולל בריכות 1-3, נהרות 4-8, נחלים 9, ומי ים 10-14. רוב המחקרים האלה התמקדו גילוי של יחיד או כמה פולשני 1,4-6,8,14 ונדירים או מאוימים מינים 3,9, בעוד מחקרים שנעשו לאחרונה כמה ניסו זיהוי סימולטני של מינים רבים בקהילות הדגים המקומי 7,9, 12,13,15 ו mesocosms 11,12.
הגישה האחרונה נקראת "metabarcoding" ועדנה metabarcoding משתמש וקבוצה אחת או מספר של פריימרים PCR כדי coamplify אזור הגן על פני דגימות מגוונות טקסונומית. זה ואחריו כנת ספרייה עם אינדוקס בנוסף מתאם, ואת הספריות באינדקס מנותחות על ידי רצף מקביל תפוקה גבוההפּלַטפוֹרמָה. לאחרונה מייה et al. 12 פיתח פריימרים PCR אוניברסלי עבור metabarcoding עדנה מן הדגים (המכונה "MiFish"). פריימרים MiFish ולמקד לאזור hypervariable של הגן המיטוכונדריה 12S rRNA (163-185 נ"ב), אשר מכיל מידע מספיק כדי לזהות דגים למשפחה, הסוג ומינים טקסונומיות למעט במבניהם כמה קשורים זה לזה. עם השימוש של פריימרים אלו metabarcoding עדנה, מייה et al. 12 זוהה יותר מ -230 מינים ימיים סובטרופי מטנקים אקווריום עם שוניות אלמוגים והרכב מינים ליד האקווריום.
תוך אופטימיזציה של פרוטוקול metabarcoding כדי להתאים מי ים טבעי עם רמות משתנות של ריכוז עדנה מן הדגים, יש לנו לב כי פריימרים MiFish נכשלו מדי פעם כדי להגביר את אזור היעד להכנת ספרייה שלאחר מכן. אחת הסיבות סבירות יותר עבור הגברת PCR מוצלחת זה הוא חוסר הכמות מספקת של template DNA הכלול בנפחים קטנים של מים מסוננים (כלומר 1-2 L). למרות ריכוז עדנה מקבוצת טקסונומיות ספציפית הוא לידיעה לפני ההגברה, סינון של כרכי מים גדולים (> 1-2 L) תהיה דרך פשוטה ויעילה כדי לאסוף יותר עדנה מן הסביבות המימיות עם שפע דגים נדיר ביומסה, כגון מערכות אקולוגיות תחת כיפת האוקיינוס במעמקי הים.
ביחס מסננים סיבים דיסק כמקובל בשימוש במספר של מחקר עדנה דגי 16, מחסניות מסננות יש את היתרון של אדיב כרכי מים גדולים לפני סתימת 17. למעשה, מחקר שנערך לאחרונה הראה נפח גדול (> 20 L) סינון של דגימות מי ים החוף באמצעות מחסניות מסננות 18. בנוסף, הם בנפרד ארוזים וסטרילי, וכמה מדרגות העבודה הניסיונית יכולות להתבצע בית המסנן, ובכך להקטין את ההסתברות של זיהום מהמעבדה 19. האחרוןתכונה חיונית עדנה metabarcoding, שבו את הסיכון לזיהום נותר בין הניסוי הגדול אתגרים 20,21. למרות היתרונות הטכניים האלה של מחסניות מסננות, זה לא נעשה שימוש במחקרי עדנה של דגים עם שני חריגים 8,15.
כאן אנו מספקים פרוטוקול עבור סינון של דגימות מים עם מחסנית מסנן וסחיטת עדנה ממסנן שלה מבלי לחתוך את הדיור. כמו כן אנו מספקים שתי מערכות סינון מים חלופיות תלוי כרכי מים (L ≤4 או> 4 L). כדי להשוות את הביצועים של הפרוטוקול החדש שפותח ובפרוטוקול בעבר בשימוש באמצעות מסנן מזכוכית בקבוצת המחקר שלנו 12,14,22,23, אנו מבצעים עדנה metabarcoding ניתוח של מי ים מטנק אקווריום ענק (7,500 מ '3 ) עם הרכב מינים, ולהראות את מספר המינים שזוהו נגזרים משני הפרוטוקולים כתוצאות נציג. h פרוטוקול זהכפי שפותחו עבור metabarcoding עדנה מן הדגים, אך גם לגבי עדנה מאורגניזמים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקרים רבים metabarcoding באמצעות דגימות סביבתיות כגון מים ואדמה, טיפול סינון לתפקיד מחסנית המסנן הוא בדרך כלל כדלקמן 24,25: 1) חיתוך פתוח או פיצוח דיור עם כלי יד (חותך צינורות או צבת); 2) הסרת המסנן מהמחסנית; ו -3) חיתוך המסנן לחתיכות קטנות עם סכין גילוח להפקת DNA. כדי להימנע …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1-L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10-mL pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10-L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 mL conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
References
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
- Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
- Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
- Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
- Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316 (2013).
- Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
- Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520 (2013).
- Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732 (2012).
- Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
- Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088 (2015).
- Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
- Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a ‘snapshot’ of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786 (2016).
- Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
- Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA – a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
- Stewart, F. J., DeLong, E. E. . Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. 10, 187-218 (2013).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161 (2009).
- Smalla, K., Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. . Molecular Microbial Ecology Manual. , 13-22 (1995).
- Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA – An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
- Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383 (2015).
- Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
- Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
- Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
- Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
- Deiner, K., Walser, J. -. C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
- Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
- Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A., Micic, M. . Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples’Springer Protocols Handbooks. , 325-339 (2016).
- Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
- Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
- Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
- Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).
