JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

שיטה למדידת RNA<em> N</em<sup> 6</sup> שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות

Published: December 05, 2016
doi:
10.3791/54672
, ,
1Department of Cardiology,Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

שיטה סופגת צפונית שונה למדידת N 6 -methyladenosine (מ 6 א) שינויים ב RNA מתוארת. השיטה הנוכחית יכולה לזהות שינויים ב RNAs ובקרות מגוונות תחת עיצובים ניסיוניים שונים.

Abstract

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

Introduction

Dynamic and reversible RNA modifications have important roles in RNA homeostasis. Four decades ago, N6-methyladenosine (m6A) modifications were found to be abundant in eukaryotic transcriptomes1. They have diverse functions in messenger RNA (mRNA), ribosomal RNA (rRNA), small nucleolar RNA, transfer RNA, and microRNA2. The m6A modifications of mRNA influence their splicing3, translation4, degradation5, and localization2. Moreover, they affect ribosome biogenesis and microRNA function6. The evolutionary conservation of m6A modifications of RNA is noted in unicellular bacteria to multi-cellular humans7. Delineation of the roles of m6A modifications is currently under extensive exploration. The efforts are expected to provide new insights into transcription control. Recent studies reveal that other chemical modifications of mRNA8 also play critical roles in RNA metabolism.

Circadian rhythms9, stem cell pluripotency10, triglyceride metabolism4, fibrosis11, obesity12, and major depression13 are a few examples of processes where m6A modifications are known to control outcomes. Many circadian clock gene transcripts have m6A sites14. Modulation of m6A methylase or demethylase elicits circadian period changes15. Mettl3, an m6A transferase, is a regulator for stem cell pluripotency. A deficiency of Mettl3 leads to early embryonic lethality and aberrant lineage priming at the post-implantation stage10. A deficiency of fat mass- and obesity-associated (FTO), an m6A demethylase, in adipocytes affects fatty acid mobilization and body weight through posttranscriptional regulation of Angptl44. These studies reveal that m6A not only controls mRNA processing, but also plays critical roles in embryological development and patho-physiology. The function of m6A modifications holds implications for therapeutic considerations in the future.

Several methods are available to measure m6A modifications of RNA16-18. Traditionally, thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) are used to study the distribution of m6A in several RNAs19,20. Mass spectrometry is a sensitive tool for the detection of m6A modifications in RNA. However, the RNA needs to be excised by RNase into short fragments before analysis by mass spectrometry21. Methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (m6A-Seq)22 immunoprecipitates fragmented RNAs with m6A-specific antibodies and performs parallel RNA sequencing. This method generates transcriptome-wide m6A landscapes. High-resolution mapping of m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation (miCLIP) further maps m6A modifications at a single-nucleotide resolution23. Both methods provide details of m6A modification across the whole transcriptome, with specific genes’ information. However, quantifications and standardization in both methods are difficult if experiments require the comparison of multiple conditions. Moreover, fragmentations of RNA for m6A-Seq alter the original RNA structure, which may affect native m6A levels. To detect global m6A modifications of RNA and their changes under different experimental conditions, we report a method that employs a modified northern blotting protocol. This method resolves RNA by molecular weight, using gel electrophoresis18. This procedure provides better standardization and quantifications for experiments that involve multiple conditions or samples. It also provides specific m6A modification information for different RNAs, whether rRNA, mRNA, or microRNA.

Protocol

הערה: רנ"א הכל מ 6 רמה כוללת rRNA, mRNA, ו RNA קטנים אחרים. מאז RNA ריבוזומלי יש מ שופע 6 שינויים A, מדידת מ 6 הבגרויות תצטרך לשקול את העובדה הזו. בידוד RNA 1. באמצעות פתרון טיהור ribonuclease (מרוסס על מגבות נייר), לנגב את טפטפות ומשטחי ספסל מעבדה. מגבות נייר רטובות עם מי nuclease ללא ולנגב טפטפות ומשטחי ספסל במעבדה שוב. הפקת RNA בידוד RNA סה"כ שימוש בוחש עילי, homogenize 50-100 מ"ג של רקמה או 5-10 x 10 6 תאים 1 מ"ל של תמיסת בידוד RNA שמרו על 4 מעלות צלזיוס. הערה: רקמה יותר (100-150 מ"ג) עשויה להידרש דגימות רקמה שומניות מעכברים בגלל ריכוזי RNA הנמוכים בו. דוגמאות שמקורו מן הלב העכבר, כבד, שרירי השלד, ריאות, מוח, מקרופאגים הועסק 4 בעבר. בcubate homogenates מדגם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הוספת 100 μL של 1-bromo-3-chloropropane (BCP) לכל 1 מ"ל של homogenate המדגם. לנער את צינורות בתוקף למשך 15 שניות ולהמשיך לבודד רנ"א הכל על פי הוראות היצרן 24. Polyadenylated mRNA טיהור מ- RNA סה"כ מבודד לטהר mRNA polyadenylated באמצעות ערכות או פרוטוקולים זמינים. לנער היטב מחדש להשעות כל אחד מהפתרונות הבאים: פתרון מחייב 2x, אוליגו חרוזי פוליסטירן (DT), והפתרון לשטוף. ודא אוליגו (DT) חרוזים חם לטמפרטורת החדר לפני השימוש. העבר 120 μL של פתרון elution לכל הכנה לתוך צינור וחום עד 70 ° C בתוך גוש חימום. פיפטה עד 500 מיקרוגרם של רנ"א הכל לתוך צינור microcentrifuge. עם nuclease ללא מים, להתאים את עוצמת הקול כדי 250 μL. הוסף 250 μL של פתרון מחייב 2x אל רנ"א הכל כךlution מערבולת בקצרה לערבב את תוכנו. הוסיפו 15 μL של אוליגו (DT) חרוז מערבולת ביסודיות לערבב. דגירה את התערובת על 70 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. הסר את המדגם מגוש החימום ולתת לו לעמוד בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 2 דקות. מוציאים בזהירות את supernatant, משאיר מאחוריו כ 50 μL. הוספת 500 μL של פתרון לשטוף מחדש להשעות את הגלולה ידי pipetting. פיפטה ההשעיה לתוך מערכת צינור ספין מסנן / אוסף. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 2 דקות. הסר את עמודת צינור איסוף וזורק את הזרימה דרך. החזר את עמודת צינור האיסוף. פיפטה 500 μL של פתרון לשטוף על מסנן הספין. צנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 2 דקות. מעביר את מסנן הספין לתוך צינור איסוף טרי. פיפטה 50 μL של פתרון elution מחומםעד 70 ° C על גבי במרכז מסנן הספין. דגירה של 2-5 דק 'ב 70 ° C. צנטריפוגה ב 15,000 XG דקות 1. פיפטה נוסף 50 μL של פתרון elution מחומם ל -70 מעלות צלזיוס על גבי במרכז מסנן הספין. חזור על שלב 1.2.2.1.18. הוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​גליקוגן, 0.1 נפח של 3 M חיץ נתרן אצטט (5.2 pH), ו 2.5 כרכים של אתנול אבסולוטי. משקע הלילה ב -80 ° C. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 25 דקות ב 4 °. בטל supernatant. שטפו את הכדור עם 1 מ"ל של אתנול 75%. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. מוציאים בזהירות את אתנול. יבש באוויר במשך 3-5 דקות. הוסף 10 μL של מי nuclease ללא לפזר את הגלולה. חנות ב -70 ° C. הכשרת RNA וכימות באמצעות ספקטרופוטומטר, לקבוע את ריכוז RNA על ידי NotIng את הספיגה ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר. יחס 260/280 צריך להיות 1.8-2.2. בדוק את איכות המדגם RNA באמצעות 0.8% ג'ל agarose אלקטרופורזה 25. הערה: רנ"א הכל ללא פגע איקריוטיים צריך להראות 28S אינטנסיבי 18S rRNA להקות. יחס 28S לעומת עוצמת להקת 18S rRNA עבור הכנת RNA טובה הוא ~ 2. 2. ג'ל אלקטרופורזה והסעה הערה: הפרוטוקולים כן חיץ ניתנים בטבלת 1. הכנת ג'ל פורמלדהיד (1%) יש לשטוף את כל הציוד אלקטרופורזה עם diethylpyrocarbonate (DEPC) מים. ממיסים 2.5 גרם של agarose ב 215 מ"ל מים DEPC לחלוטין במיקרוגל. הוסף 12.5 מ"ל של 10x 3- (N- morpholino) חומצה propanesulfonic (מגבים) חיץ 22.5 מ"ל של פורמלדהיד 37%. יוצקים את התערובת לתבנית המנגנון אלקטרופורזה עם מסרק סמיך 1.5 מ"מ. לחסל בועות או לדחוף tשולי עד הקצוות הג'ל במסרק נקי. אפשר הג'ל לחזק בטמפרטורת החדר. לדוגמא הכנה מערבבים 1-10 מיקרוגרם של RNA סך 11.3 μL של חיץ מדגם. מערבבים 2 מיקרוגרם של הסמן RNA (1 מיקרוגרם / μL) עם 11.3 μL של חיץ מדגם. מוסיפים מים nuclease ללא דגימות 2.2.1 ו 2.2.2 כדי בהיקף כולל של 16 μL. מחממים על 60 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן לצנן על הקרח. מערבבים 16 μL של המדגם מ 2.2.3 עם 4 μL של צבע מעקב, המכיל 0.1 מיקרוגרם / μL ethidium ברומיד על הקרח. זהירות: ברומיד Ethidium הוא אולי טרטוגניות ורעילים אם נשאף. קרא גליון בטיחות ברומיד ethidium. אלקטרופורזה הוסף 200 מ"ל של 10x מגבים חיץ ל -1,800 מ"ל של DDH 2 O לבצע למאגר פועל מגבים 1x. השתמש למאגר פועל מגבי 1x לשטוף את הבארות של ג'ל. t טרום ריצההוא הג'ל על 20 V למשך 5 דקות. טען את דגימות רנ"א לתוך הבארות של ג'ל. מכסים בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור. הפעלה ב 35 V עבור כ -17 שעות (לילה) בדוק ולצלם את הג'ל תחת אור UV. לְהַעֲבִיר חותכים את ג'ל להסרת החלק בשימוש. הכן 500 מ"ל של 10x חיץ SSC (250 מ"ל של חיץ 20x SSC ו 250 מ"ל מים DEPC). שטפו את הג'ל פעמיים עם חיץ 10x SSC במשך 20 דקות עם רועד ב 50 סל"ד. חותכי 1 נייר סינון גיליון גדול מספיק כדי לשמש נייר פתילה, אשר סופג חיץ העברה ממגש ההעברה (איור 1). חותכים 4 חתיכות של נייר סינון לאותו גודל כמו ג'ל. חותכים 1 גיליון קרום ניילון חיובי טעונים לאותו גודל כמו ג'ל. סמן חריץ על הג'ל ואת הקרום כסמן כדי להבטיח את הכיוון הנכון. משרים את הממברנה חיץ 2x SSC במשך 15 דקות. יוצקים 500 מ"ל of 10x SSC חיץ למגש ההעברה. הנח את גיליון נייר סינון גדול על פני הצלחת זכוכית להרטיב את נייר הסינון עם חיץ העברה. מרדד כל בועות עם טפטפת. משרי 2 חתיכות של נייר סינון מראש לחתוך חיץ העברה ומניח אותם על המרכז של נייר הסינון משלב 2.4.5. הסר את כל בועות. הנח את הדף בצד ג'ל למטה על נייר הסינון. הנח את קרום על גבי הג'ל. ישר את החריצים של הג'ל ואת הממברנה. מניחים 2 חתיכות של נייר סינון מראש לחתוך על גבי הממברנה ואת להרטיב את נייר הסינון עם חיץ העברה. הסר את כל בועות בין השכבות. החל בניילון סביב הג'ל על מנת להבטיח כי רק מגבה לספוג חיץ עובר דרך ג'ל הממברנה. סטאק את מגבות נייר על גבי נייר הסינון. מניח צלחת זכוכית גדולה על גבי המגבות. מניחים משקל על החלק העליון של הערימה. שמור לילה לאפשר RNA להעביר מן הג'ל על הממברנה. 3. איתור של N 6 -methyladenosine ממברנה Crosslinking שמור את קרום לחת חיץ 2x SSC. מניחים 2 גיליונות נייר מסנן שקוע עם 10x חיץ SSC לתוך crosslinker UV. מניחים את קרום על גבי נייר הסינון, כשהצד RNA-adsorbed פונה כלפי מעלה. בחר "מצב autocrosslink" (120,000 μJ) ולחץ על כפתור "התחל" כדי להתחיל את ההקרנה. בדוק את הממברנה ואת ג'ל עם לוכד תמונה ג'ל UV כדי לאשר את העברת RNA מן הג'ל על הממברנה. immunoblotting חסום את הממברנה ב 5% חלב דל שומן מלוחים טריס שנאגרו עם 20 Tween (TBST) חיץ בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. לשטוף שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות. דגירה הממברנה לילה מ 6 (<em> N 6 פתרון נוגדנים -methyladenosine) (1: 1,000 ב 5% דל שומן חיץ חלב TBST) ב 4 ° C.. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות. דגירה הממברנה ב HRP-מצומדות חמור פתרון נוגדנים נגד ארנב (1: חיץ 2,000 5% דל שומן חלב TBST) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות. החל את המצע chemiluminescent משופרת (0.125 מ"ל לס"מ 2 של קרום). ללכוד את chemiluminescence עם ההגדרות האופטימליות של תרמי הדיגיטלי, על פי הוראות יצרן 26. מ 6 כימות למדוד את עוצמת chemiluminescent היחסית מ 6 באמצעות תוכנת ImageJ. בתפריט התוכנה ImageJ, בחר באפשרות "קובץ" כדי לפתוח את הקובץ הרלוונטי. בחר באפשרות "מלבן" מ ImageJ ולצייר על ידי מסגרת סביבאת האותות. אם RNA ריבוזומלי הוא לא המוקד של ניסויים, להימנע להקות ריבוזומלי 18S ו -28 RNA מ 6 לחישוב. לחץ על "פיקוד" ו "1" כדי לאשר את השביל שנבחר. לחץ "פיקוד" ו "3" כדי להראות את העלילה שנבחרה. לחץ על הכלי "ישר" לצייר קווים כדי להפריד את האזור המפולח. לחץ על הכלי "שרביט" כדי לרשום את המידות. לייצא את הנתונים. לנרמל את רמות א מ 6 עם להקת RNA ריבוזומלי 18S מן המכתים ברומיד ethidium.

Representative Results

לאחר 14 ימים בשלב יממה רגיל-כהה אור, עכברי wild-type הונחו בחשכה מתמדת. RNAs מהכבד נדגמו ב 4 במרווחים hr ולמד עם סופג הצפוני שונה. מתילציה של rRNAs, mRNAs, ו RNA הקטן התגלתה בבירור (איור 2). ההשוואה בין זמני יממה שונים (CT) ניתן לחשב במדויק עם תקן 18S rRNA. הייתה תנודת יממה חזקה של רמות מ 6 ב rRNA, mRNA, ו RNA הקטן. כדי למנוע את ההפרעה שהוצעה על ידי rRNA, RNAs polyadenylated יכול להיות מטוהר, כמו בשלב 1.2.2. לאחר הטיהור, rRNA ניתן למנוע במידה רבה, כדי לאפשר ויזואליזציה טובה יותר של RNAs האחר (איור 3). <stron g> איור 1: רכבת יחידת העברת כתם. יחידת העברת נימים עבור סופג את הרנ"א על ​​הקרום מוצגת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2: קצב היממה של בחינות הבגרות מ 6 ב C57BL / 6J. נתון זה מראה את מ 6 כתם של RNA הכולל כבדים עכברי-בר הקריב ביום הראשון של השלב הכהה כהה לאחר 14 ימים של שלב אור כהה רגיל ב 4 במרווחי h. כימות נעשה באמצעות מ 6 הפרש צפיפות התמונה בין 18S ו -28 rRNA. מ '6 שפע היה מנורמל הלהקה 18S rRNA מן הג'ל פורמלדהיד בתחתית.et = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3: כתמי הקלע זרק 6 עם או בלי rRNA. כתמי נציג מ 6 א 'של רנ"א הכל ו- RNA polyadenylated מן הכבדים של עכברי-בר מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 1 חיץ 10x מגבים (pH 7.0, להגן מפני אור) מגבים 41.85 g 0.2 M אצטט נתרן 4.1 g 0.05 מ ' EDTA, Disodium מלח 3.7 g 0.01 M מי DEPC סה"כ 1 L מערבבים בטמפרטורת החדר 2 20x חיץ SSC (pH 7.0) נתרן כלורי 175.3 g 3 M ציטראט Trisodium 88.3 g 0.3 M מי DEPC סה"כ 1 L </td> מערבבים בטמפרטורת החדר, ואז החיטוי 3 דיי מעקב חיץ 10x מגבים 500 μL 1x Ficoll 400 0.75 g 15% bromophenol כחול 0.01 g 0.2% קסילן Cyanol 0.01 g 0.2% מי DEPC סה"כ 5 מ"ל חנות ב -20 ° C 4 מי DEPC לדלל יחס של 1: 1,000 של DEPC DDH 2 O מערבבים למשך הלילה בטמפרטורת החדר, ואז החיטוי 5 חיץ מדגם (להגן מפני אור) חיץ 10x מגבים 200 μL 37% פורמלדהיד 270 μL Formamide 660 μL חנות ב -20 ° C </tbody> טבלה 1: חוצצים ופתרונות.

Discussion

Modifications of RNA have important roles in cellular function and physiology. The current understanding of the regulation, function, and homeostasis of these modifications is still being explored and expanded8. Therefore, a precise and gold-standard method to evaluate the modifications of RNA is needed. The modified northern blotting method provides precise quantification of RNA modifications and clear delineation of the modifications in diverse RNAs. Although the method requires at least 3 days, it can be standardized and can be used in various experimental designs. Moreover, with different antibodies, it can detect different RNA modifications27.

It is important to separate different RNAs when analyzing RNA modifications. Ribosomal RNA comprises a large portion of the total amount of RNA28,29. The results from analyzing RNA modifications only in total RNA will represent mostly the changes of rRNA. Methylation and other such modifications of rRNA could potentially mask the changes in other RNAs. With the procedure of gel separation, the modifications of mRNA and other small RNAs can be more accurately analyzed.

Transcriptome-wide mapping with m6A immunoprecipitation and sequencing provides detailed insight into the modification of each type of RNA22. It provides information on the specific RNAs and a resolution of around 80-120 bp. Although m6A-Seq can compare the modifications between different experimental conditions, the selection of proper standards and controls for such experiments is difficult18. Immunoprecipitation is difficult to reproduce, often giving significant variations amongst repeats. Moreover, m6A-Seq requires the fragmentation of RNA samples before immunoprecipitation and sequencing30. The fragmentation process could potentially induce undue influences on the original RNA modifications. If the experiment does not need the specific gene’s information but requires different conditions for comparison, the current method provides better visualization and control for diverse experimental setups.

Modification of RNA is an important step in regulating transcriptional control31. However, the homeostasis and the regulatory mechanisms of various RNA modifications under diverse physiological realms are still unclear. Using the present modified northern blotting method, different RNA modifications can be quantified and compared. Furthermore, the changes and regulations of RNA modifications can be investigated in greater detail. In the future, it could also be possible to combine the experimental data from both the classical northern blotting and the modified northern blotting protocols, providing greater insights into RNA biology.

The most important factor determining the success of the modified northern blotting protocol is the integrity of the RNA sample. RNAs with some amount of degradation may yield good classical northern blotting results, but this could potentially have significant impact on the modified northern blotting results. The modifications of RNA in different tissues or cell lines could also vary significantly. It is important to test the suitable RNA sample loads for different tissues before performing the final experiments.

As blotting procedures have been traditionally named after Dr. Southern and different geographical directions, we propose the name “northeastern” blotting for the current technique.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

C.Y.W. received support from the National Health Research Institute (NHRI-EX101-9925SC), the National Science Council (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009), and Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091, and CMRPG3C1763).

Materials

RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10X MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll 400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
filter paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thammana, P., Held, W. A. Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro. Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).
  2. Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
  3. Niu, Y., et al. N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).
  4. Wang, C. Y., et al. Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism. Sci Signal. 8 (407), 127 (2015).
  5. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  6. Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One. 10 (2), 0118438 (2015).
  7. Deng, X., et al. Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).
  8. Dominissini, D., et al. The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. , (2016).
  9. Fustin, J. M., et al. RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock. Cell. 155 (4), 793-806 (2013).
  10. Geula, S., et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).
  11. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. , (2016).
  12. Jia, G., et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).
  13. Du, T., et al. An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population. J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).
  14. Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome. Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).
  15. Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription. Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).
  16. Heyn, H., Esteller, M. An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine. Cell. 161 (4), 710-713 (2015).
  17. Xiao, W., et al. Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing. Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).
  18. Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3′ UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  19. Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).
  20. Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).
  21. Golovina, A. Y., et al. Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis. Nucleic Acids Res. 42 (4), 27 (2014).
  22. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  23. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  24. Fu, L., et al. Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method. Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).
  25. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445 (2010).
  26. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. 6, 18874 (2016).
  27. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome. Nat Chem Biol. , (2016).
  28. Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons. J Vis Exp. (90), (2014).
  29. Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq. J Vis Exp. (74), (2013).
  30. Mishima, E., et al. Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides. PLoS One. 10 (11), 0143756 (2015).
  31. Klungland, A., Dahl, J. A. Dynamic RNA modifications in disease. Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).

Tags

RNA N6-methyladenosineRNA EpigeneticsNorthern BlottingRNA ModificationsN6A DetectionRNA IsolationAgarose Gel ElectrophoresisMOPS BufferFormaldehydeSSC BufferRNA Transfer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wang, C., Lin, M., Su, H. A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (118), e54672, doi:10.3791/54672 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image