Entfernung von<em> Drosophila</em> Muskelgewebe aus Larval Filets für Immunfluoreszenzanalyse von sensorischen Neuronen und epidermalen Zellen
Summary
Studien der neuronalen Morphogenese unter Verwendung von Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen profitieren von in – situ – Visualisierung von neuronalen und epidermalen Proteine durch Immun. Wir beschreiben ein Verfahren, das durch Entfernen von Muskelgewebe aus der Larvenkörperwand Immunfluoreszenzanalyse von da Neuronen und die umliegenden Hautzellen verbessert.
Abstract
Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen sind ein beliebtes Modell für Mechanismen der neuronalen Morphogenese zu untersuchen. Da Neuronen entwickeln in Kommunikation mit den Epidermiszellen sie innervieren und so ihre Analyse Nutzen aus in situ Visualisierung beider neuronal und epidermal exprimierten Proteine durch Immunofluoreszenz. Traditionelle Methoden der Larven Filets für Immunofluoreszenz Experimente vorbereiten lassen das Muskelgewebe intakt, dass die meisten der Körperwand erstreckt, mehrere Herausforderungen zu meistern neuronalen und epidermalen Proteine Bildgebung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Muskelgewebe von Drosophila Larven Filets entfernen. Dieses Protokoll ermöglicht die Abbildung von Proteinen, die ansonsten durch Muskelgewebe verdeckt sind, verbessert die Signal-Rausch-Verhältnis, und erleichtert die Verwendung von Superauflösungsmikroskopie DA-Neuronenentwicklung zu untersuchen.
Introduction
Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen bieten ein wertvolles Modell für die neuronale Entwicklung des Studiums aufgrund ihrer Zugänglichkeit für genetische Manipulation und die Leichtigkeit , mit der sie abgebildet werden kann. Diese sensorischen Neuronen wurden bei der Identifikation zahlreicher Wege instrumental die Dendriten Morphogenese 1-3 steuern.
Vier Klassen von da Neuronen (Klasse I – IV) innervate die Larven Epidermis. Diese Neuronen liegen zwischen der Basalmembran der Epidermis und mit ihren Dendriten bilden weitgehend zweidimensionale Arrays 4,5. Von den vier Klassen, Klasse IV da Neuronen sich die hochverzweigten Lauben haben und, wie sensorische Neuronen von anderen Tieren, erfordert die Ausarbeitung dieser Dorne intrinsischen Faktoren sowie Hinweise aus benachbarten Geweben, insbesondere die Epidermis, für ihre Entwicklung 6-9 .
Studien, um festzustellen, wie solche neuronale und extra neuronale Tatsacheors steuern Dendriten Morphogenese Nutzen aus der Fähigkeit , die Proteinexpression in situ durch Immunfluoreszenz nachzuweisen. Die äußere Kutikula der Larve ist undurchdringlich für Antikörper, aber dieses Hindernis wird durch die Herstellung von Larven Filets durch gut etablierte Dissektion Methoden 10,11 leicht zu überwinden. Allerdings stellt die Körperwand Muskelgewebe, die gerade Inneren der Basalmembran liegt einige Herausforderungen zu Visualisierung von da Neuronen und epidermalen Zellen. Erstens, das Muskelgewebe, welche Linien die meisten der Körperwand, verschleiert stark fluoreszierende Signale von neuronalen oder epidermale Gewebe ausgeht. Dies reduziert erheblich das Signal-Rausch-Verhältnis in der Probe. Zweitens sind viele relevante Proteine werden in das Muskelgewebe sowie in den Neuronen oder Epidermis exprimiert wird. Dieser Muskel abstammenden Fluoreszenzsignal wird weiter zu verdunkeln Erfassung eines Fluoreszenzsignals von dem Neuron oder Epidermis wahrscheinlich. Schließlich Fortschritte in der Mikroskopie-Technologien keinew Genehmigung Bildgebung von Proben , die bei Unterbeugungs Auflösung und kann besonders hilfreich bei der Lokalisierung von Proteinen anspruchsvolle , die in Neuronen und die umliegenden Zellen der Epidermis 12,13 exprimiert werden. Allerdings Bildgebung mittels superauflösende Mikroskopie profitiert von einem starken Signal-Rausch-Verhältnis und die Nähe der Probe auf dem Deckglas. Zusätzlich zu dem Signal-Rausch-Verhältnis zu reduzieren, die Larvenkörperwand Muskel Abstände da Neuronen aus dem Deckglas, wodurch die verbesserte Bildauflösung zu begrenzen, die mit Superauflösungsmikroskopieverfahren erreicht werden kann. Neben Herausforderungen für die Immunfluoreszenzanalyse, stellt das Muskelgewebe eine Barriere für die Aufnahme elektro von sensorischen Neuronen im Larvenkörperwand. Seine Entfernung profitiert daher neurophysiologischen Manipulation von sensorischen Neuronen 14.
Hier ist ein Verfahren zur manuellen Entfernung von Drosophila Larve Muskelgewebe beschrieben. Wir zeigen, dass unser Protokoll permits Immunofluoreszenz Bildgebung von Proteinen, die sonst durch Muskelgewebe verdeckt, verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis für die Visualisierung der Klasse IV da Neuronen und ermöglicht die Verwendung von Superauflösungsmikroskopie zur besseren räumlichen Beziehungen von Proteinen und Zellstrukturen in da Neuronen unterscheiden und die Epidermis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier ist ein Protokoll für die manuelle Entfernung von Muskelgewebe von Drosophila Larven Filets beschrieben. Dieses Protokoll modifiziert vorher Larven- Dissektion Techniken beschrieben 10,11. Nachdem die Larven in einer Silikonelastomerschale zergliedert wird, wird der dorsalen Mittellinie befindet. Eine einzelne Zange Zinke, in seiner flachsten mögliche Ausrichtung, ist zwischen dem Muskelgewebe und der Epidermis, in der Nähe der Rückenmittellinie sorgfältig eingeführt. Die Zange gezogen san…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Gary Laevsky für hilfreiche Diskussionen über die Mikroskopie. Diese Arbeit wurde von NIH finanziert gewährt R01GM061107 und R01GM067758 zu ERG
Materials
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22×22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
References
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
- Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111 (2011).
- Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
- Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
