ブリルアン分光法のための細胞外マトリックスのタンパク質繊維の調製

この実験（ 図SI-1A）で使用されるブリルアン分光装置は、以前に記載されている。9は、単一モードの試料に76 mWの出力パワーで532nmの固体レーザを用います。 20センチメートル色消しレンズは、試料にレーザ光を集光し、後方散乱ジオメトリのサンプルからの散乱光を収集します。タンデムマルチパスファブリペロー干渉計は、その後、低雑音フォトダイオード検出器によって検出される散乱光をフィルタリングするために使用されます。このアプローチは、エタロンの自己整合ピエゾスキャンにより非常に高いコントラスト（ 約 120デシベル）と安定性を提供します。偏光子及び検光子が入射し、散乱光の偏光を選択するために導入されます。スペクトルは、通常、O偏光子は、入射光の偏光の垂直（V）方向、あるいは垂直方向（V）を選択する分析器を選択する固定されたままで得られます散乱光の偏光のR、水平（H）方向。この構成では、縦方向および横方向の音響モードがそれぞれ検出されます。 典型的なブリルアンスペクトル弾性散乱およびサンプルの力学の署名である均等にシフトピーク、またはブリルアンダブレット 、の1つまたは複数の組に強い中央のピークを有します。これらの測定では、散乱光は、表面に対して平行な（PSモード）走行バルクフォノンから、準直交サンプルに走行バルクフォノン両方から発信され、試料基板界面における入射光の反射の後にすることができる。9 図2は、30 GHzの自由スペクトル範囲は、0.2 GHzの解像度でVV偏光で得られた乾燥および水和トリプシン消化し ​​たコラーゲン繊維のBLSスペクトルを示し、約10分間の収集時間スペクトルあたり。各スペクトルは、θ、回転の特定の角度に対応します （ 図SI-1C）。 θ= 0°での乾燥コラーゲン繊維で、縦モードは、PSモードながら（18.92±0.02）GHzでバルクピークを生じさせる（9.85±0.03）ギガヘルツ（ 図2A）です。同じ範囲内でθを変える時に低い周波数へのPSピークシフトθが 90°（フォノンラジアル方向をプロービング）に0°（繊維の軸配向をプロービングフォノン）から行くように、バルクピークに対し、ごくわずかに赤方偏移（フォノンは回転を通じて準半径方向をプロービング）。湿ったコラーゲン繊維では、原因縦フォノンに2つのピークが4.9ギガヘルツ（ 図2B）で約 10.5 GHzおよびPSピークにおけるバルクピークに、実験を通して本質的に不変です。これは、18.92のデータに対するピーク周波数の80〜100％の減少を（示しそして、9.85 GHzの、それぞれ）、従って水和に起因する材料の剛性、の。水和したコラーゲンのバルクおよびPSモードは水が果たした支配的な役割で、その弾性定数は、水と繊維の寄与の組み合わせであることを示唆し、純水のモードに周波数に近くにあることに注意してください。 図3は、VH偏波とθ= 30°で測定された乾燥トリプシン消化し ​​たコラーゲン繊維のスペクトルを示します。 VV偏波の漏洩は、PSおよびバルクピークはまだ観察することができます。横モードは（4.1±0.2）GHz帯（θ= 0°）0°〜90°からθの変化として少し青シフトでピークを占めています。両方の横方向およびPSピークに対するフィット結果も示されています。ピークパラメータを抽出し、音響波速度は、V L = Vの λ/√2として得ました<eメートル> vが曲線フィットのピークの分析とλによって得られたモードの周波数は、励起波長、532 nmです。従って、;（ 図SI-1B、C散乱ジオメトリのために、Q S = 2、K iが （Φ）を SIN）このジオメトリにおいて、材料の屈折率の知識が音響モードの速度を得るために必要とされないことに注意してくださいこのアプローチは特に有利になります。 図4は、角度θの関数として縦と横モード（PSとTピーク）から得られた弾性波速度のプロットであります 。下記の式A1とA2 – -六方対称弾性ソリッド7のモデルにフィット分析では、ドライトリプシン消化型の弾性テンソルの5つのコンポーネント私は繊維（ 表1）コラーゲンを提供します。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withinページ= "1">縦横音波速度は9で与えられます。 、（A1） 、（A2） ρは材料の密度、およびc 11、C 33、44 CおよびC 13がどこにある六角形の対称性を持つシステムを特徴づける5弾性定数の4です。第五の定数は、12 C、12〜C 11 Cおおよその関係に由来することができる- 。2 C 44 7 係数は、以前に未精製コラーゲンfibeから得られたものと類似していますRS。9顕著な違いは、弾性率Eの同様の値に反映されている13係数cのために発生しǁとE 精製されたコラーゲン（約7.2および7.7 GPaで）。 図5は、θ対湿ったコラーゲンの縦弾性波速度のプロットであります 。この場合、周波数の周期的な変化は、誤差の範囲内で一定速度を与え、観察されない。 図6は、θ= 0°で測定された乾燥および水和エラスチン線維のスペクトルを示す図 。横モードは、これらのサンプルのために検出されませんでした。乾燥エラスチンでは、バルクピークは、8.2 GHzの9（13および20％の乾燥コラーゲンの対応するピークよりも低い）でPSモードながら、16.8 GHzで発生します。湿ったエラスチン繊維は、バルクpを提示します（12.30±0.01）ギガヘルツ（乾燥エラスチンのバルクピークよりも周波数が37％以下）でEAK。湿ったエラスチンのPSモードがあるため、それらの周波数での弾性ピークの激しい尾のスペクトルには明らかではありません。一方、 約 7.5 GHzでのピークは、バルク水に起因します。 図7は、θに乾燥エラスチン繊維内の音響波速度の依存性を示します。これらのデータから、弾性テンソル成分（および機械的弾性率）は、（ 表1）を得た。9湿ったコラーゲンのように、等方性の証拠は水和エラスチン繊維の機械的弾性率です。これらの結果は、ブリルアン分光法は、剛性、組成や材料の構造的側面に関連する情報を与えることができる方法を示しています。 Fiのグレ1. アコースティックと原子の1次元鎖中の光学フォノン。一次元二原子チェーンにおける音響と光の振動の模式図。原子は質量m 1およびm 2を有し、交互。矢印は原子の変位を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 私はラットの尾の腱からコラーゲン線維トリプシン精製型の 図2 ブリルアンスペクトル。（A）乾燥繊維及び（B）のスペクトルは、度で、繊維軸θに対して異なる角度でVV測定から繊維を水和。純粋な蒸留水のスペクトルも示されています。スペクトルは、バルクピークの強度（高さ）に標準化しました。標識B及びPSは、それぞれ、バルク及びパラレル表面モードに関するピークを示します。エラーバーは標準誤差（カウント数の平方根）を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 私はラットの尾の腱からコラーゲン線維ドライトリプシン精製タイプの 図3 ブリルアンスペクトル。スペクトルθでのVHの測定から = 30°。ラベルT、PSお​​よびBは、それぞれ、平行に面横に関連するピークは、バルクモードを示します。 TとPSの両方のモードの減衰調和振動子（DHO）モデルを使用してフィット分析の結果も示されています。エラーバーは標準誤差（カウント数の平方根）を示します。/54648fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 繊維軸に対して角度対ドライトリプシン精製コラーゲン中の弾性波速度の 図4. プロット。ブリルアンピークのフィット分析から得乾燥コラーゲン繊維の縦方向と横方向の弾性波速度。データは、六方対称弾性固体のモデルに適合しています。レッドライン：式A1（R 2 = 0.99）。青線：式A2（R 2 = 0.36）。エラーバーは、ブリルアンスペクトルのフィットレーベンバーグ・マルカート非線形最小二乗した後、共分散行列の対角要素の平方根から得られた標準誤差を示している。 より大きなversiを表示するには、こちらをクリックしてください。この図の上。 繊維軸に対して角度対ウエットトリプシン精製コラーゲンの縦弾性波速度の 図5. プロット。ブリルアンピークのフィット分析由来の水和コラーゲン繊維の縦弾性波速度。示される線は、目のためのガイドであり、この範囲内で音響波速度の平均値を与えます。エラーバーは、ブリルアンスペクトルのフィットレーベンバーグ・マルカート非線形最小二乗した後、共分散行列の対角要素の平方根から得られた標準誤差を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 JPG "/> ウシ項靱帯からエラスチン線維の 図6. ブリルアンスペクトル。θで乾燥および水和繊維のスペクトル = 0°。スペクトルは、バルクピークの強度（高さ）に標準化しました。標識B及びPSは、それぞれ、バルク及びパラレル表面モードに関するピークを示します。 B FとB Wは 、それぞれ、繊維と水のバルクピークを参照してください。エラーバーは標準誤差（カウント数の平方根）を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 繊維軸に対して角度対乾燥エラスチンの縦弾性波速度の図7.プロット。ドライエラスチン嘘の縦弾性波速度ERブリルアンピークのフィット分析由来。データは、六方対称弾性固体のモデルに適合しています。レッドライン：式A1 9（R 2 = 0.74）。エラーバーは、ブリルアンスペクトルのフィットレーベンバーグ・マルカート非線形最小二乗した後、共分散行列の対角要素の平方根から得られた標準誤差を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図SI-1。ブリルアンセットアップおよびBLS散乱ジオメトリの概略図（A）固体レーザによって放射された入射光は、色消しレンズを介して試料に送られます。バルク音響フォノンによって、およびREFLから生じるものによって散乱された光試料と接触する基板表面での光のectionは、レンズによって集めタンデムマルチパスファブリペロー干渉計によって濾過し、光電子増倍管によって検出されます。 FP1とFP2は、タンデムセットアップを構成する2つの干渉計を示しています。偏光子は、入射光の偏光を選択し、分析器は、散乱光の偏光を選択するために使用されます。 （B）は、反射性シリコン基板の表面に接触する検体と形状をBLS。スライドガラス（図示せず）が区画を密封するために、試料の上に配置され、穏やかな圧力を基板の隅部のパッドを介して印加されます。入射光（K i）は 、レンズを通過し、空気サンプルインターフェース（K 'I）で屈折し、サンプル基板の界面に集光されます。同じレンズバルクフォノンの両方との相互作用から（K さん ）の結果（qで収集した散乱光b）及びサンプル（Q sのもの走行PS）。 。光の方向と表面の法線間の角度がΦとΦ」として示されている（C）サンプルのと採用座標系の模式図。 zは 、繊維の方向に異常軸を平行に定義されています。 。事件の波数と光散乱; q個の B、Q：θの角度αは k iを 、K 'I、K、S、K のそれぞれのz -軸にbをフォノンのQ sおよびqの方向との間のものであり、それぞれの 、バルクおよびPSモードの波数ベクトル、。 （参考文献9から転載） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <pクラス= "jove_content"のfo：弾性波速度の適合分析から得キープして-next.within-ページ= "常に"> 表1弾性テンソル係数 Iは（コラーゲン線維ドライトリプシン精製型の弾性テンソル係数この作業）とエラスチン繊維（文献9）。 サンプル 弾性係数（GPA） トリプシン消化したコラーゲン C 33 18.7±0.1 C 11 14.4±0.2 C 44 3.4±0.1 C 12 7.2±0.2 C 13 11.2±0.3 エラスチン C 33 11.5±0.2 C 11 10.4±0.1 C 44 1.9±0.2 C 12 6.6±0.2 C 13 6.8±0.3