JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物工程

הכנת סיבי חלבון תאי מטריקס עבור ספקטרוסקופיה ברילואן

Published: September 15, 2016
doi:
10.3791/54648
, , , , , ,
1School of Physics and Astronomy,University of Exeter, 2Department of Physics and Geology,University of Perugia, 3Istituto Officina dei Materiali del CNR,Unità di Perugia

Summary

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Abstract

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

Introduction

פיזור אור ברילואן (BLS) האפקט התגלה על ידי לאון ברילואן בשנת 1922. 1 הוא מורכב של הפיזור הקשיח של אור הנראה על ידי פונונים אקוסטי מופעלים תרמית בחומר. בפיסיקה של מצב מוצק, פונונים אקוסטי הן תנודות קוהרנטית של כל האטומים בסריג. שרשרת חד ממדית של שני סוגי לסירוגין של אטומים בסריג היא מודל פשוט הממחיש את ההבדל בין פונונים אקוסטית, נחשפו על ידי BLS, ו פונונים אופטי, נחקרו על ידי קליטת IR ו פיזור ראמאן (איור 1). פונונים אקוסטיות נמצאים פאזיים תנועות של אטומים בשרשרת עם תזוזה לאורך כיוון התפשטות (פונונים אקוסטי האורך) או בניצב לכיוון התפשטות (רוחבי פונונים אקוסטית), תוך פונונים אופטי הם מחוץ פאזיים תנועות של אטומים הפקת מומנט דיפול חשמלי נדנוד (אורך או מצבים רוחביים).

spectro BLSscopy נעשה שימוש במדע אנליטיים מאז 1920; עם זאת, רק מאז 1980 יש מדידות ניגודיות גבוהה התאפשרה הודות לשימוש ספקטרומטר פברי פרו- multipass טנדם. מאז, מספר גדל והולך של ההתקדמות BLS עבור יישומים אנליטיים החומר המעובה (שבו האינטראקציה-פונון פוטון מנוצלת) 2-4 ומגנטיות חומרים (באמצעות אינטראקציה פוטון-מניון) 5 הובא על. עבודות הזרע על יישומים ביו 6-8 סללו את הדרך לפיתוח גישות שונות, כולל אחת מיושם פה אחד שתואר לעיל 9 באמצעות מצע רעיוני בתצורה דמוי טסיות להשיג את התיאור המלא של מותח גמישות דוגמית.

בעבודה הנוכחית, אנו מיישמים ספקטרוסקופיה BLS אל מרכיביו הבסיסיים של תאי מטריקס ברקמות חיבור, החלבונים הסיביים אלסטין Type I-קולגן. Type לי קולגן הוא מולקולת סליל נוקשה, משולשת אשר מרכיבה רוחבי longitudinally עם לחצות קישור נרחב ליצירה סיבית נוקשה למעשה ברקמות כגון גידים. רשתות של קולגן שלרוב מתקיימות עם רשתות של אלסטין, חלבון אשר, באופן יוצא דופן, יוצר גמישות לטווח ארוך באמצעות שילוב של אנטרופיה אינטראקציות הידרופוביות עם הסביבה והוא חיוני לפונקציות של רקמות כגון ריאות ועור. סיבי שניהם מודל באמצעות מודל קריסטל משושה במחקר הנוכחי. 9 בחלק 1, אנו מתארים את הפרוטוקול לחלץ סיבים מרקמות של בעלי חיים כדי להכין את המדגם עבור מדידות ספקטרוסקופיות. בחלק 2, ההליך להקמת המנגנון ברילואן ורכישת ספקטרה מסיבי מוצג. חלק 3 נותן פרטים של ניתוח נתונים להחיל את ספקטרום ברילואן כדי לחלץ את המידע המכאני הרלוונטי הכלול בו. לאחר מכן, תוצאות נציגים מוצגות discusseד.

Protocol

זהירות: יש להתייעץ פרוטוקולי בטיחות ביולוגיים וכל גיליונות נתוני בטיחות חומרים הרלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. הלייזר המועסקים ניסויים אלה היא לייזר 3B מחלקה; ועמידה בכללי מקומי לשימוש בטוח של המערכת נדרשת. אנא להשתמש בכל שיטות הבטיחות המתאימות בעת ביצוע מדידת ספקטרוסקופיה ליזר כולל השימוש בציוד מגן אישי (משקפי בטיחות). גידי זנב התקבלו חולדות Wistar ישנות 7-8 בשבוע המורדם למטרות אחרות בהתאם לתקנות איחוד אירופאיות 1099/2009 ורווחת בעלי החיים (שחיטה או הריגה) לתקנות 1995. רצועות עורפיות השור התקבלו מטבחיים מקומי. 1. הכנת סיבים לדוגמא הערה: סיבי חלבון של מטריקס ניתן לחלץ מרקמות שונות, באמצעות הליכים שונים. פרוטוקולים זוקקו בהתאם לנהלים מיושמים באופן נרחב. <strong> הפקת סיבי קולגן מזנב עכברוש הקורבן עכברוש ידי הזרקה תוך הצפק של 100 מ"ג / ק"ג של pentobarbitone נתרן משקל הגוף. ואז לנתק את הזנב ישירות בנקודת המגע עם הגוף, לחיצה עם סכין גילוח חד בקצה. עוטפים את הזנב בניילון ולאחסן קפוא זה ב -20 ° C עד הנדרשים. אסוף בזנב מהמקפיא, לחתוך קטע ארוך 20 מ"מ מהקצה הפרוקסימלי תוך עדיין קפוא ואז להשאירו להפשיר בצלחת פטרי מלאות בופר פוספט (PBS) פתרון (pH 7.4) בשעה RT. לאחר הזנב הוא מופשר, עושים חתך לאורכו של קטע באמצעות אזמל לפצל את העור. ואז לקלף בחזרה לחשוף ארבע צרורות גיד עטופות על חולית הזנב. בעזרת מלקחיים בסדר נזהרים שלא חל כל-זן מראש, בעדינות לצייר כל סיב מתוך מעטפת ולמקם אותו בקבוקון המכיל מים מזוקקים עם 0.01% w / v אזיד הנתרן (NaN 3) יחסי ציבוראירוע התפתחות חיידקים, ולאחסן בקירור. זנב יחיד מניב סביב שלושים סיבי הגיד. כדי לקבל סוג סיבי טהור שאני קולגן, להחיל תהליך עיכול אנזימטי שלושה חלק 10 לסיבי הגיד להסיר את proteoglycans וכל חומר noncollagenous אחר. ראשית, לטבול את הסיבים 0.125 U / ml chondroitinase ABC ב 0.05 חיץ M טריס ו 0.06 M נתרן אצטט (CH 3 COONa) ב- pH 8.0 למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס חממה רועד ב 200 סל"ד. לאחר מכן, לטבול את הסיבים 1 U / ml hyaluronidase Streptomyces 0.05 חיץ M טריס ו 0.15 M נתרן כלורי (NaCl) ב- pH 6.0 ולחזור אל האינקובטור רעד במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לבסוף, לטבול את הסיבים 1 מ"ג / מ"ל של טריפסין ב 0.05 M פוספט נתרן (NaHPO 4) ו 0.15 M NaCl ב- pH 7.2 עבור 16 שעות בחממה רועד ב 37 ° C. אחסן את סיבי מטוהרים המצוננים בקבוקונים המכילים מים מזוקקים, wi0.01 ה% NaN 3 על מנת למנוע התפתחות חיידקים, עד הנדרשים למדידה. הפקת סיבי האלסטין מן הרצועה עורפית שור השג רצועה עורפית שור מן מטבחיים, לעטוף אותו בניילון ולאחסן קפוא זה ב -20 ° C עד השימוש. כדי לייצר אלסטין טהור, לאסוף את הרצועה מהמקפיא, לאפשר לו להפשיר ב RT, defat זה באמצעות אזמל ולעכל את הרצועה באמבט מים רותחים על פי הנוהל Lansing, 11 כדלקמן. כן 0.1 M פתרון של נתרן הידרוקסידי (NaOH) במים מזוקקים ולהוסיף אותו הרצועה הנטולה השומן בבקבוק חרוטים, מכסה את הרקמה. מרתיח את הבקבוק בתוך אמבט מים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. הסר את הרצועה מבקבוק העיכול ולשטוף את גוש הרקמה המסיס במים מזוקקים מספר פעמים עד pH 7.0 (פיקוח באמצעות מד pH) מתקבל. הסרת הרקמה מהגמרלשטוף פתרון לצלול אותו במים מזוקקים (מעורבב עם 0.01% NaN 3 על מנת למנוע התפתחות חיידקים) במיכל אטום ולאחסן אותו בקירור. אסוף את רקמות מהמקרר, נזהרים שלא להפעיל כוח רב מדי-זן מראש, פינצטה שימוש למשוך פלחי ואלסטין קטן בעדינות (20 עד 50 מ"מ אורך, בערך 2 מ"מ עובי) הרחק בלוק גדול יותר ומניחים אותם בצלחת פטרי עם פתרון PBS (pH 7.4). בעזרת מלקחיים בסדר, בעדינות להקניט צרורות סיבים קטנים סביב 1 מ"מ עובי וחותכים אותם באורכים של כמה מ"מ באמצעות אזמל. מעבירים את סיבי כדי בקבוקונים המכילים מים מזוקקים (עם 0.01% NaN 3 על מנת למנוע התפתחות חיידקים) ולאחסן בקירור אותם עד הנדרשים למדידה. הרכבת הסיבים על מצע רעיוני באמצעות חותך יהלומים, לחתוך חתיכה של שקופיות סיליקון רעיוניות. כדי ליצור compartme hydratedNT, לחתוך רצועה של Parafilm כדי להתאים את השקופית סיליקון עם חתך חלול במרכז (גדול מספיק כדי להתאים סיב) ולמקם אותו על גבי המצע סיליקון. הערה: עבור מדידות סיבים יבשות, לחתוך את parafilm לתוך צורת U כך שאחד מארבעת הצדדים נשאר פתוח לאוויר כאשר אטום בשלב 1.3.4. הסר את הסיבים מהמקרר, להשתמש זוג מלקחיים בסדר לאסוף סיב בודד מפתרון האחסון ומניח אותו בצלחת קטנה פטרי מלא מים טהורים ב RT במשך 5 דקות כדי לשטוף את המדגם. לאחר מכן, לאסוף את הסיב ולהעבירו למרכז החלול parafilm על פני מצע סיליקון. זהירות: למנוע נזק סיבים ידי מותח אותו במהלך פעולה זו, ולהימנע לצידוד המדגם על פני המצע, מכיוון שהדבר עלול לגרום לשינוי תכונות מכניות. מניח coverslip זכוכית דק על הסיבים ולאטום את החדר על ידי עובר מלחם מחומם בעדינות על משטח הזכוכית כדי להמס את parafilm מתחתהזכוכית. זהירות: למנוע נזק סיבים לא להביא למצב קצה הלחמה קרוב מדי או חימום המצע מוגזם. הנח את התא האטום על משטח שטוח תחת משקל קטן ולהשאיר אותה במשך כ -12 שעות כדי להשיג קשר טוב בין המצע המדגם סיליקון, תוך הימנעות ניזק הדגימה. הסר את המשקל ולאבטח את התא במקום על פני המצע, באמצעות ברגים. 2. הגדרת הניסוי ברילואן ורכישת סיבים ספקטרה הכנת תא מדגם הר מדגם מוכן כמו חלק 1.3 על בעל אנכי מצויד goniometer לאפשר סיבוב מטוס של המדגם תוך שמירה על זווית פיזור קבוע (2 Φ = 90 °, ראה איור SI-1) ופיזרו עמדה נפח. בצע התאמה מדויקת להתמקד של אור הליזר על המדגם דרך leננו-שניות. 9 זהירות: הכוח פלט לייזר עשוי להיות גבוה מדי ולייצר כוויה במדגם. ודא כי הוא מוגדר גבוה מספיק כדי לתת רגישות טובה אך לא גבוהה מדי כדי למנוע נזק המדגם. כאן השתמשנו כוח של CA. 76 mW על המדגם. זה היה מספיק כדי לקבל רגישות טובה בלי לשרוף את המדגם, גם בהתחשב שמדובר דק במגע עם מצע מסייע שמגרש את החום שנוצר על ידי תאורת ליזר. מקם את המדגם בזווית של 45 מעלות (Φ) אל קרן הלייזר האירוע באמצעות סולם Vernier. להשיג מיצוב אופטימלי על ידי הפעלת מדידה למקסם את עוצמת הפסגות בספקטרום (ראה להלן). הגדרת ספקטרומטר פתח את התוכנה לרכישה ומניפולציה של הנתונים ולהגדיר את רכישת ספקטרום ברילואן של המדגם 12. ההליך המתואר כאן חל על muאינטרפרומטר טנדם ltipass (איור SI-1A). יישר את השנייה פברי פרו- (FP) התאבכות שינוי המתח עצמאי להחיל את פייזו ידי יחידת הבקרה. עבור הליך טרום יישור זה, מלאו אחר האור המוחזר על ידי כל FP. כאשר עוצמת שמשתקף שני FPS שואף לאפס, את היישור הנכון הוא הגיע. כיול הספקטרום: טווח התדרים נגישים, או בטווח הספקטרום חינם (FSR), תלוי את המרחק בין שתי מראות של חלל FP הראשון, L, דרך FSR = c / 2 L, כאשר c היא מהירות האור L נמדדת על ידי מד חיוג. סנכרן את הסריקות של שתי התאבכות FP ולעבור המערכת האופטית לתצורת multipass טנדם. פקד משוב של עוצמת אור הליזר מועברת אוטומטית ישמור על היישור של שני FPS במהלך המדידה. למדידת רמת נוזלf ברילואן ספקטרה זהירות: הספקטרום ברילואן תלוי מאוד הטמפרטורה הידרציה של המדגם ובקר כה נזהר בפרמטרים הוא מפתח להשגת ספקטרום לשחזור. התחל רכישת ספקטרום ברילואן של המדגם ולהפעיל אותו עד יחס אות לרעש טוב מושגת. פעולה זו עשויה להימשך מספר דקות, בהתאם חתך פיזור, הריכוז והעובי של המדגם. הערה: אין כלל אצבע עבור יחס אות לרעש אבל האיכות ספקטרלי נבדקת על ידי בניסויים על פי המדגם המבוקש המנותח. יש trade-off בין איכות רפאים ומשך המדידה, ולכן הפרמטרים הניסיונות צריכות להיבחר בהתאם ליישום הספציפי. עבור המדידה של דגימות יבשות, את הספקטרום רצוף – עבור כל אחד מהם, לאחר שלב 2.3.1 – עד אין שינויים במצב של הפסגות iים שנצפה. זו מושגת כאשר המדגם הוא בשיווי משקל עם האווירה בחדר ולא ייבוש נוסף ישפיע על הספקטרום. בחר את קיטוב האור (VV או VH; V מייצג אנכיים H עבור הכיוון האופקי של יחסי קיטוב האור לכדור פיזור) ולרכוש ספקטרום בכל זווית לציר סיבים (θ; איור SI-1) על ידי החלפה של מדגם מטוס ביד. שמור את הספקטרום ברילואן להגיש לעיבוד שלאחר מכן. 3. ניתוח של ברילואן ספקטרה הערה: ניתוח Fit של פסגות ברילואן ניתן לבצע באמצעות פונקציות שונות. מתנד הרמוני דיכא (DHO) 4,13 פונקציה נבחר זהו מודל תקף פסגות שמקורם מצבי אקוסטי דיכא במדיה viscoelastic. ניתוח Fit של פסגות ברילואן בחר את טווח הספקטרום עבור השיא של עניין הדואר ספקטרום ברילואן. אפשר בסיס ב בכושר אם ברקע ספקטרלי הוא הרבה יותר גבוה מאפס. הערה: הבסיס יכול להשתנות בין ספקטרומים. ודא כי התיקון מיושם באופן שיטתי לשחזור. למרוח ריבועים מפורטים לפחות הולם באמצעות פונקציה DHO 4,13 אל פסגת ברילואן עניין איטרטיבי עד ההתכנסות מושגת ואת עקומת ההתאמה האופטימלית מתקבלת. כעת שמור את התוצאות לנכון להגיש. השג ערכים ממוצעים מהפרמטרים ההתאמה של שני שיאים של כל כפיל ברילואן. חשב את מהירות גל אקוסטי מתדירות השיא (באמצעות הביטוי להלן). מגרש את תוצאות בכושר באמצעות גרפים, למשל, מהירות גל אקוסטי לעומת זווית לציר סיבים, θ , ולהחיל מודלים רלוונטיים (למשל, עבור מערכות איזוטרופי אקוסטית 9) כדי לחלץ כמויות מכאניות כגון מקדמי מותח גמישות.

Representative Results

מנגנון ספקטרוסקופיה ברילואן השתמש בניסוי זה (איור SI-1A) תואר בעבר. 9 היא מעסיקה במצב יחיד 532 ליזר מצב מוצק ננומטר עם ספק מוצא 76 mW על המדגם. עדשת אכרומטית 20 סנטימטר מתמקדת אור הליזר על המדגם ואוספת את האור המפוזר מן המדגם בתוך גיאומטרית backscattering. אינטרפרומטר טנדם multipass פברי פרו- משמש לסינון האור המפוזר, אשר נלכד על ידי גלאי פוטודיודה רעש נמוך. גישה זו נותנת ניגודיות גבוהה מאוד (בערך 120 dB) ויציבות באמצעות פייזו-סריקה עצמית יישור של etalons. מקטב ו Analyzer מתוודעים לבחור הקיטוב של האירוע אור מפוזר. ספקטרה בדרך כלל מתקבלת עם המקטב שלה נשאר קבוע בחירה בכיוון האנכי (V) של קיטוב אירוע אור נתח בחירת לחילופין o האנכי (V)r אופקי (H) בכיוון של קיטוב האור המפוזר. בתצורה זו, מצבי אקוסטי אורך רוחביים מזוהים בהתאמה. קשת ברילואן טיפוסית יש שיא מרכזי עזים בשל פיזור אלסטי ואחד או יותר סטים של פסגות העבירו באותה מידה, או כפילויות ברילואן, אשר חתימתו של המכניקה של המדגם. במדידות אלה, האור המפוזר יכול לנבוע הוא פונונים בתפזורת נסיעה מעין-מאונך כדי המדגם, לאחר השתקפות אור האירוע על ממשק המצע המדגם, מן פונונים בתפזורת נסיעה במקביל לפני השטח (מצבי PS). 9 איור 2 מציג ספקטרום BLS של סיבי קולגן מתעכל טריפסין יבש hydrated שהושג עם הקיטוב VV ברזולוציה 0.2 GHz, עם מגוון ספקטרלי חינם 30 GHz וכ 10 דקות זמן איסוףלכל ספקטרום. ספקטרום כל תואם לזווית ספציפית של סיבוב, θ (איור SI-1C). בסיבי קולגן יבשים θ = 0 °, מצבים אורך להצמיח לשיא בתפזורת (18.92 ± 0.02) GHz בעוד מצב PS הוא (9.85 ± 0.03) GHz (איור 2 א). נ.ב. משמרות השיא תדרים נמוכים כמו θ הולך מ 0 ° (פונון חיטוט האוריינטציה צירית של סיבים) עד 90 ° (פונון חיטוט האוריינטציה רדיאלי), ואילו שיא בכמות המיוצרת מעט אדום-משמרות על שינוי θ באותו טווח (פונון חיטוט בכיוון מעין-רדיאלי לאורך הסיבוב). בסיבי קולגן רטובים, שתי הפסגות בשל פונונים אורך הם ללא שינוי מהותי לאורך הניסוי, עם השיא בתפזורת GHz בקירוב 10.5 ופסגת PS ב 4.9 GHz (איור 2 ב). זה מצביע על הפחתה בין 80 ל -100% בתדירות שיא (יחסית לנתונים של 18.92ו 9.85 GHz, בהתאמה), ומכאן של קשיחות החומר, בשל הלחות. ראוי לציין, כי מצבי בתפזורת PS של קולגן hydrated הנמצאים קרוב בתדירות בדבר דרכי מים טהורים, דבר המצביע על כך קבועים אלסטיים שלה הן שילוב של תרומות מים וסיבים תזונתיים, עם תפקיד דומיננטי בגילומו של מים. איור 3 מציג קשת רחבה של סיבי קולגן יבשים מתעכל טריפסין הנמדדת θ = 30 ° עם קיטוב VH; דליפה של קיטוב VV מאפשרת PS והפסגות בתפזורת עדיין לא אותרו. מצבים רוחביים להסביר לשיא (4.1 ± 0.2) GHz (θ = 0 °) מה שקצת כחול-משמר כשינויים θ בין 0 ° עד 90 °. תוצאות Fit היא עבור הרוחבי ופסגות PS מוצגות גם. פרמטרי שיא חולצו ומהירויות גל אקוסטי נגזרו כמו V L = v λ / √2, שם <e m> v הוא התדר של המצב מתקבל על ידי ניתוח עקום-התאמה של פסגות λ הוא גל העירור, 532 ננומטר. שים לב בגיאומטריה זה, ידע של מקדם השבירה של החומר אינו נדרש להשגת מהירות מצב אקוסטי (בשל גיאומטרית הפיזור, q s = 2 k i לחטוא (Φ); איור SI-1b, ג), ומכאן גישה עושה את זה במיוחד יתרון. איור 4 היא מזימה של מהירויות גל אקוסטי המתקבלות מצבי אורך הרוחבי (PS ו- T פסגות) כפונקציה של הזווית θ . ניתוח Fit למודל של מוצק 7 אלסטי hexagonally סימטרי – משוואות A1 ו- A2 להלן – מספק חמשת מרכיבי מותח גמישות מסוג מתעכל טריפסין יבש ואני קולגן סיבי (טבלה 1). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> מהירויות גל אקוסטי האורך רוחבי ניתנים על ידי 9 , (A1) , (A2) איפה ρ היא צפיפות של חומר, ו- c 11, ג 33, ג 44 ג 13 ארבעה מחמשת קבועים אלסטיים המאפיינות מערכות עם סימטריה משושה. הקבוע החמישי, ג 12, ניתן לגזור את היחס המשוער ג 12 ~ ג 11 -. 2 ג 44 7 מקדמים דומים לאלו שהושגו בעבר בין fibe קולגן unpurifiedrs. 9 הבדל בולט מתרחשת עבור מקדם ג 13 המשתקף לתוך ערכים דומים של E moduli אלסטי ǁ ו- E (כ 7.2 ו -7.7 GPA) עבור קולגן המטוהר. איור 5 הוא מזימה של מהירות גל אורך אקוסטי של קולגן רטוב לעומת θ . במקרה זה, לא חל שינוי תקופתי בתדירות הוא ציין, נותן מהירות קבועה בטווח הטעות. איור 6 מציג את הספקטרום של סיבי האלסטין יבשים hydrated הנמדדים θ = 0 °. מצבים רוחביים לא אותרו עבור דגימות אלה. בשנת ואלסטין יבש, השיא בתפזורת מתרחש 16.8 GHz בעוד מצב PS ב 8.2 GHz 9 (13 ו -20% נמוכים יותר מאשר הפסגות המקבילות של קולגן היבש). סיבי האלסטין רטובים מציגים p בתפזורתeak ב (12.30 ± 0.01) GHz (37% נמוך יותר בתדירות מהשיא עיקר ואלסטין יבש). מצב PS של אלסטין רטוב אינו נראה לעין בספקטרום בגלל הזנב האינטנסיבי של שיא אלסטי בתדרים אלה. מצד שני, הפסגה GHz בקירוב 7.5 מיוחסת מים בכמות גדולה. איור 7 מציג את התלות של מהירות גל אקוסטי סיבי האלסטין יבש על θ. מנתונים אלו, המרכיבים מותח גמישות (ו moduli מכני) התקבלו (טבלה 1). 9 כמו קולגן רטוב, יש ראיות של איזוטרופיות ב מודולוס מכני של סיבי האלסטין התייבשות. תוצאות אלו מצביעות על איך ספקטרוסקופיה ברילואן יכולה לתת מידע רלוונטי על קשיחות, רכב והיבטים מבניים של חומר. אלחוטיאיור 1. אקוסטיים, פונונים אופטי בשרשרת חד ממדית של אטומים. תרשים סכמטי של תנודות אקוסטיות ואופטיות בשרשרת diatomic חד ממדית. אטומים בעלי מסה m 1 ו- m 2 והם לסירוגין. החצים מצביעים על התקות של אטומים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. ספקטרה ברילואן איור 2. מסוג טריפסין-מטוהרים לי קולגן סיבי גיד זנב עכברוש. ספקטרה של (א) סיבים יבשים (B) התייבשות סיבים ממדידות VV בזווית שונה θ ציר סיבים, במעלות. קשת של מים מזוקקים טהורים גם מוצגת. ספקטרה היו מנורמלת העוצם (גובה) של השיא בתפזורת. תוויות B ו- PS לציין פסגות הקשורות נפח במקביל-קרקע מצבי, בהתאמה. ברים שגיאה מצביעים סטיית התקן (שורש ריבועי של מספר הספירות). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3. הספקטרום ברילואן מסוג יבש מטוהרים-טריפסין לי קולגן סיבי גיד זנב עכברוש. ספקטרום ממדידה VH ב θ = 30 °. תוויות T, PS ו- B מציינים פסגות הקשורים רוחביים, במקביל-קרקע מצבים בתפזורת, בהתאמה. תוצאות של ניתוח בכושר באמצעות מתנד הרמוני דיכא (DHO) מודל עבור שני מצבי T ו- PS מוצגים גם. ברים שגיאה מצביעים סטיית התקן (שורש ריבועי של מספר הספירות)./54648fig3large.jpg "Target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4. מגרש של מהירות גל אקוסטי קולגן טריפסין-מטוהרים היבשים לעומת זווית ציר סיבים. מהירויות גל אקוסטי אורך הרוחבי של סיבי קולגן יבשים העולות מניתוח התאמה של הפסגות ברילואן. נתונים מותקנים כדי מודל של מוצק סימטרי אלסטי hexagonally. קו אדום: המשוואה A1 (R 2 = 0.99); קו כחול: המשוואה A2 (R 2 = 0.36). ברי שגיאה לציין את סטיות תקן מתקבל השורש הריבועי של האלמנטים האלכסוניים של מטריקס השונה המשותפת לאחר ריבועים לפחות לינארית לבנברג- Marquardt בהתקף של ספקטרה ברילואן. אנא לחצו כאן כדי להציג versi גדול על של נתון זה. מגרש איור 5. של מהירות גל אורך אקוסטי קולגן מטוהר טריפסין הרטוב לעומת זווית ציר סיבים. מהירות גל אקוסטי אורכית סיבי קולגן hydrated העולים מניתוח התאמה של הפסגות ברילואן. השורה המוצגת הנה מדריך העין ונותנת את הערך הממוצע של מהירות גל אקוסטי בטווח זה. ברי שגיאה לציין את סטיות תקן מתקבל השורש הריבועי של האלמנטים האלכסוניים של מטריקס השונה המשותפת לאחר ריבועים לפחות לינארית לבנברג- Marquardt בהתקף של ספקטרה ברילואן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. jpg "/> איור 6. ספקטרום ברילואן של סיבי האלסטין מן הרצועה עורפית שור. ספקטרה של סיבים יבשים hydrated ב θ = 0 °. ספקטרה היו מנורמלת העוצם (גובה) של השיא בתפזורת. תוויות B ו- PS לציין פסגות הקשורות נפח במקביל-קרקע מצבי, בהתאמה. B F ו- B W מתייחסים אל הפסגות הארי של סיבים ומים, בהתאמה. ברים שגיאה מצביעים סטיית התקן (שורש ריבועי של מספר הספירות). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. מגרש איור 7. של מהירות גל אורך אקוסטי ואלסטין יבש לעומת זווית ציר סיבים. מהירות גל אקוסטי אורכית לבלף ואלסטין יבשאה העולה מניתוח התאמה של הפסגות ברילואן. נתונים מותקנים כדי מודל של מוצק סימטרי אלסטי hexagonally. קו אדום: 9 A1 משוואה (R 2 = 0.74). ברי שגיאה לציין את סטיות תקן מתקבל השורש הריבועי של האלמנטים האלכסוניים של מטריקס השונה המשותפת לאחר ריבועים לפחות לינארית לבנברג- Marquardt בהתקף של ספקטרה ברילואן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור SI-1. סכמטי של הגדרת ברילואן וגיאומטריה פיזור BLS. (א) לאור האירוע הנפלטת לייזר מצב מוצק נשלחת מדגם באמצעות עדשה אכרומטית. האור מפוזר על ידי פונונים אקוסטי בתפזורת ועל ידי אלה הנובעים רפלקטיביתשיקוף של אור על פני שטח המצע, אשר נמצא בקשר עם המדגם, נאסף על ידי העדשה, מסונן על ידי אינטרפרומטר טנדם-multipass פברי פרו- ו זוהה על ידי מכפיל. FP1 ו FP2 לציין שתי ההתאבכות המהווה את הגדרת טנדם. מקטב בוחר את הקיטוב של אור האירוע, וכן מנתח משמש כדי לבחור את הקיטוב של אור מפוזר. (ב) גיאומטרית BLS עם דגימה במגע עם פני השטח של מצע סיליקון רעיוני. שקופית זכוכית (לא מוצג) ממוקמת מעל הדגימה לאטום את התא, ובלחץ עדין מוחל באמצעות כריות בפינות של המצע. אור האירוע (i k) עובר דרך העדשה, משתקף על ממשק אוויר המדגם (k 'i) וממוקד על ממשק מדגם המצע. האור המפוזר שנאסף על ידי אותה העדשה (k 's) תוצאות מאינטראקציה עם שני פונונים בתפזורת (qב) ואלה PS נסיעה של המדגם (ים q). . זוויות בין כיווני אור ואת הנורמלים אל פני השטח מסומנות ככאלה Φ ו Φ '(C) תרשים סכמטי של המדגם של מערכת קואורדינטות המאומצת; z מגדיר את מקביל לציר היוצא דופן לכיוון הסיבים. זוויות θ ו α הם אלה בין כיוון פונונים ש S ו q 'ב z ציר, בהתאמה k i, k' i, k ים, k 's:. Wavenumbers האירוע ופיזרו אור; B & Q, q ים, וקטור גל של חלק הארי מצבי PS, בהתאמה. (נדפס מן נ"צ 9.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <pclass > בטבלה 1. מקדמי מותח אלסטיים העולים מניתוח בהתקף של מהירויות הגל אקוסטי מקדמים מותח אלסטיים מסוג טריפסין-מטוהרים יבשים ואני קולגן סיבי (. עבודה זו) ואת סיבי האלסטין (נ"צ 9). לִטעוֹם מקדמי אלסטי (GPA) קולגן טריפסין-מתעכל ג 33 18.7 ± 0.1 ג 11 14.4 ± 0.2 ג 44 3.4 ± 0.1 ג 12 7.2 ± 0.2 ג 13 11.2 ± 0.3 ואלסטין ג 33 11.5 ± 0.2 ג 11 10.4 ± 0.1 ג 44 1.9 ± 0.2 ג 12 6.6 ± 0.2 ג 13 6.8 ± 0.3

Discussion

ספקטרוסקופיה ברילואן הפיזור היא כלי ייחודי שבו הרכיבים הבודדים של מותח האלסטיות של סיבי חלבון ניתן לאפיין בפירוט חסר תקדים. יתר על כן, המדידות יכולות להתבצע על בקנה מידה מיקרוסקופי ובכך תספקנה לנו תובנה רומן לתוך מכניקת מייקרו בקנה המידה של מבנים ביולוגיים, מה שמאפשרים לנו, בפעם הראשונה, כדי להבין את המכנים, וכנראה תפקודי, משמעות של המורכבויות באדריכלות וביוכימיה מטריקס אשר נחשף בשנים האחרונות.

הטכניקה מודדת תכונות מכאניות בתחום תדרי GHz. תחום זה לא נחקר לפני עבור biopolymers מבני וזה הוא מעלה מספק את האמצעים כדי לענות על שאלות בסיסיות אודות מנגנונים מולקולריים של גמישות.

תיארנו את השלבים הדרושים כדי לחלץ סיבי קולגן ואלסטין מרקמות של בעלי חיים כדי למדוד ברילואן scattering ספקטרום באמצעות מצע רעיוני כדי להשיג את התיאור המלא של ביומכניקה סיבים. צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול הם אלה המבטיחים כי סיבי מטוהרים מתקבלים תנאי ניסוי מתאימים נמצאים במקום למדידות לשחזור של החלבונים הסיביים. עם זאת, הוא חייב לזכור כי הליכי המיצוי רשאיים לשנות את התכונות המכאניות של הסיבים.

שינויים של הטכניקה כרוך הצימוד עם מיקרוסקופיה אופטית עבור פיזור ברילואן microfocused ומיפוי מתקרב 13 ואת השילוב האפשרי עם טכניקות משלימות (למשל, פיזור ראמאן). יישומים נוכחיים של הטכניקה הם התמקדו בעיקר חומרים ביולוגיים ניכרים, אבל התפתחויות חשובות, למשל, אלה המבוססים על etalons VIPA מספר 14, עושים אפשרי התרגום של טכניקה זו מן המעבדתיים אל מיטתו עם מגוון רחב של יישומים כבר שדstrated 15,16 כולל פוטנציאל ביישומים vivo. גישת VIPA מהווה חלופה למה שאנו מתארים; יש לו זמן רכישה מהר אבל אינו מתאים בהכרח במקרה של דגימות אטומות כגון אלה נתחו כאן. יתר על כן, השימוש מצע רעיוני אינו מעשי קופצים להגדיר המשתמשות etalons VIPA כי בניגוד שלהם לא יהיה מספיק כדי לדחות את האור מעין-אלסטי. מגבלות הקשורות למהירות של רכישת מערך נתונים ספקטרליים ואת חתך פיזור החלש מטבעו של החומר עלולות להגביל יישומים למערכות ביולוגיות דינמיות לרכישת נתונים ממעמקי רקמות, אבל חידודים טכניים עשויים לשפר על ביצועים נוכחיים.

BLS מבטיח להיות כלי מרכזי במחקר ביו-יסודי על תאי מטריקס ובכך לייצר תובנות חדשות אודות האבולוציה של תכונות מכניות במהלך הצמיחה מטריקס ההפסד שלהם פתולוגינִווּן. עם זאת, חשוב לזכור כי המדידות הן לא פולשנית, ולפיכך עלולה להתבצע in vivo. ואכן, זה כבר הושג בתוך הקרנית 16 ו עבודה כזו עשויה לספק פלטפורמה לפיתוח כלי אבחון חדש עבור מגוון רחב של הפרעות רקמות חיבור.

elastography אולטראסאונד במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הם שיטות חלופיות המדידה micromechanical, אבל הטכניקה BLS מציעה רזולוציה מרחבית טובה יותר (בסולם subcellular) מאשר לשעבר, ובניגוד AFM, מטילה שום כוחות מכניים על הדגימה אינו מוגבל הניתוח רק של תכונות פני השטח. moduli ברילואן של קולגן ואלסטין הם בטווח GPA, תוך moduli של צעירים זנים מקרוסקופית הם בסדר גודל של מגפ"ס (לפרטים נוספים ידווחו במקום אחר). תוצאה זו מצביעה על מודולוס הפרש אלסטי עם תלות חזקה על תדר העירור, בשלהתנהגות viscoelastic של הסיבים. BLS ניתן ליישם במגוון רחב של בעיות וחומרים במדעים ביו. זה יכול לעזור לענות על שאלות על הפיזיולוגיה והפתולוגיה של רקמות ביולוגיות, כמו גם לספק כלי פיזי עבור הבנה בסיסית של חומרים ואינטראקציות ברמה המולקולרית.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.

Materials

Chondroitinase ABC Sigma-Aldrich C2905
Tris Buffer Fluka 93358
Sodium Acetate Fisher Scientific S608-500
PBS Sigma-Aldrich P4417
Sodium Azide Fisher Scientific S2002
Streptomyces Hyaluronidase  Sigma-Aldrich H1136-1AMP
Sodium Chloride Fisher Scientific S7653
Trypsin Sigma-Aldrich T4665
Sodium Phosphate Sigma-Aldrich S9638
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S320-500
Pure Water Millipore ZRQS0P3WW Produced In-House 
Distilled Water Bibby Scientific Limited D4000 Produced In-House from water still
Euthatal Merial  J01601A 
Tandem Interferometer TFP-1 JRS Scientific Instruments
Freezer Lec TU55144
Refrigerator Zanussi ZBA15021SA
Hot Plate Fisher Scientific SP88857206
Clamps VWR 241-7311 & 241-7201
Clamp Stand VWR  241-0093
Thermometer Fisher Scientific 13-201-401
Cling Film Sainsbury's 7650540
Parafilm Sigma-Aldrich P7793-1EA
Silicone IDB Technologies N/A No catalogue number. Order upon request
Cover Glass VWR 631-1571
Conical Flask VWR 214-1175
Beaker VWR 213-0469
Measuring Cylinder VWR 612-3838
Vial VWR 548-0051 & 548-0863
Petri Dish VWR 391-0441
Scalpel Swann Morton Ltd  0914 & 0308
Diamond Scribe RS Instruments 394-217
Soldering Iron RS Instruments 231-5332
Fine Forceps VWR 232-0188
Double Micro-Spatula VWR Various Sizes
pH Meter Hanna Instruments HI-2210-02
Orbital Shaker IKA  0002819000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brillouin, L. Diffusion de la lumière et des rayonnes X par un corps transparent homogène; influence de l’agitation thermique. Ann. Phys. 17, 88-122 (1922).
  2. Caponi, S., Corezzi, S., Mattarelli, M., Fioretto, D. Stress effects on the elastic properties of amorphous polymeric materials. J. Chem. Phys. 141 (21), 214901 (2014).
  3. Mattarelli, M., Montagna, M., Still, T., Schneider, D., Fytas, G. Vibration spectroscopy of weakly interacting mesoscopic colloids. Soft Matter. 8 (15), 4235-4243 (2012).
  4. Comez, L., Masciovecchio, C., Monaco, G., Fioretto, D., Robert, E. C., Robert, L. S. . Solid State Physics. 63, 1-77 (2012).
  5. Madami, M., et al. Direct observation of a propagating spin wave induced by spin-transfer torque. Nat. Nanotechnol. 6 (10), 635-638 (2011).
  6. Harley, R., James, D., Miller, A., White, J. W. Phonons and the elastic moduli of collagen and muscle. Nature. 267 (5608), 285-287 (1977).
  7. Cusack, S., Miller, A. Determination of the elastic constants of collagen by Brillouin light scattering. J. Mol. Biol. 135 (1), 39-51 (1979).
  8. Vaughan, J. M., Randall, J. T. Brillouin scattering, density and elastic properties of the lens and cornea of the eye. Nature. 284 (5755), 489-491 (1980).
  9. Palombo, F., et al. Biomechanics of fibrous proteins of the extracellular matrix studied by Brillouin scattering. J. R. Soc. Interface. 11 (101), (2014).
  10. Sivan, S. S., et al. Age-related accumulation of pentosidine in aggrecan and collagen from normal and degenerate human intervertebral discs. Biochem. J. 399 (1), 29-35 (2006).
  11. Soskel, N. T., Wolt, T. B., Sandberg, L. B., Leon, W. C. . Methods in Enzymology. 144, 196-214 (1987).
  12. Fioretto, D., Scarponi, F. Dynamics of a glassy polymer studied by Brillouin light scattering. Mater. Sci. Eng. A. 521-522, 243-246 (2009).
  13. Palombo, F., Madami, M., Stone, N., Fioretto, D. Mechanical mapping with chemical specificity by confocal Brillouin and Raman microscopy. Analyst. 139 (4), 729-733 (2014).
  14. Scarcelli, G., Yun, S. H. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Opt. Express. 19 (11), 10913-10922 (2011).
  15. Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy. Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
  16. Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt. Express. 20 (8), 9197-9202 (2012).

Tags

Extracellular MatrixCollagenElastinBrillouin SpectroscopyTendonChondroitinase ABCStreptomyces HyaluronidaseTrypsinBovine Nuchal LigamentSodium HydroxideWater Bath

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Edginton, R. S., Mattana, S., Caponi, S., Fioretto, D., Green, E., Winlove, C. P., Palombo, F. Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy. J. Vis. Exp. (115), e54648, doi:10.3791/54648 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image