Starlet Deniz Anemone Aboral physa Tam Polip Regeneration uyaran<em> Nematostella vectensis</em
Summary
Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.
Abstract
Cnidarians ve özellikle Hydra, hasarlı veya kopmuş yapıları ve aslında belki 250'den fazla yıl önce Trembley çalışmaları sayesinde, modern biyolojik soruşturma başlattı tür çalışmaları yeniden oluşturmak için gösterilen ilk hayvanlar vardı. Halen rejenerasyon çalışması süngerler gelen memeliler aracılığıyla bu Hydra, planaria ve Urodeles hem "klasik" rejeneratif organizmaları kullanarak bir diriliş yanı sıra metazoada aralığını kapsayan türlerinin genişletme spektrumunu gördü. biyolojik bir fenomen olarak içsel ilgi yanı sıra, rejenerasyon türlerinin çeşitli nasıl çalıştığını anlamak rejeneratif süreçleri ortak özellikleri ve / veya türler veya bağlam özgü hücresel ve moleküler mekanizmaları paylaşan olup olmadığı hakkında bize bilgi verecek. Starlet deniz anemon, Nematostella vectensis, rejenerasyon için gelişmekte olan bir model organizmadır. Hydra gibi, Nematostella ama t içinde, antik filum, Cnidaria üyesidirO sınıf Anthozo'lar, evrimsel daha bazal olan Hydrozoa kardeş clade. Nematostella rejenerasyon Böylece yönlerini karşılaştırmak ve Hydra ve diğer cnidarians olanlar ile kontrast ilginç olacaktır. Bu yazıda, bisect gözlemlemek ve physa denir Nematostella yetişkin, bir aboral sonu yenilenmesini sınıflandırmak için bir yöntem mevcut. physa doğal eşeysiz üreme için bir araç olarak fisyon maruz ve doğal atom ya physa elle kesilmesi ya kompleks morfolojilerin yeniden büyüme ve bir reformasyon tetikler. Burada bir Nematostella Rejenerasyon Evreleme Sistemi (NRSS) bu basit morfolojik değişikliklere kodlanmıştır var. Biz klorokin etkilerini, lizozomal fonksiyonunun blokları otofaji inhibitörü test etmek için NRSS kullanın. Sonuçlar Otofaji inhibe edildiğinde, polip yapıların, özellikle mesenteries, rejenerasyon anormal olduğunu göstermektedir.
Introduction
Tek bir hydra rejenerasyon gözlem deneysel bilim 1,2 olarak biyoloji gelişiyle seminal olay oldu. Yenilenme biyolog olağanüstü geniş temyiz fenomen kalır ve hem kişiyi yatıyordu. İnsan rejenerasyon sınırları anlamak ve üstesinden gelmek için gelişimsel biyologlar, klinisyenler, biyomedikal bilim adamları ve doku mühendisleri için potansiyel daha içsel ilginç daha rejenerasyon biyoloji yapar.
Şimdi, böyle genom dizileme ve kazanç ve fonksiyon araçları kaybı olarak ortaya çıkan teknolojilerin kullanımı ile, alan dışında rejeneratif mekanizmaların kızdırmak için hazırlanıyor ve sonuçta yeniden nasıl çeşitli türler anlamak için diğerleri olamaz. Moleküler, hücresel ve morfolojik tepkileri ortaklık derecesi aydınlatılamamıştır gerekmektedir, ancak bugüne kadar yeniden oluşturabilirsiniz hayvanlar arasında temel tepkiler olmuştur IMAGI olurdu daha benzer olduğu görülmektedirned sadece on yıl önce 3.
Özellikle cnidarians morfolojik çeşitlilik geniş bir yelpazede ortasında neredeyse tüm vücut parçaları rejenere de kolay bulunmaktadır. yalnız tatlı su polipi itibaren, Hydra gibi Portekizli Man-O-War gibi karmaşık sömürge siphonophores, için, büyük mercan resifleri inşa minik deniz polip ile birlikte, rejenerasyon için bir mekanizmaya ek olarak, çoğu kez üreme şeklidir tamir veya yaralanma ve avlanma sonucu hasarlı ya da kayıp vücut parçaları reform. Cnidaria farklı türler rejenerasyonu için benzer veya farklı mekanizmaları kullanmak ister temelde ilginç bir soru 4-6.
Bu ve diğer Anthozoan gelişmekte olan, Nematostella rejenerasyon 7-17 için bir model olarak vectensis. Biz son zamanlarda Abora gelen bisected doku morfolojik üniforma parça bir tüm vücudun yenilenmesini açıklayan bir evreleme sistemi geliştirmiştirpolip 10 l sonu. Herhangi bir düzeyde ikiye zaman Nematostella polipler yeniden iken, biz bu doğal aseksüel fisyon 18 normal düzlemine yakın olduğu için kısmen, en morfolojik basit bölgede, physa bir aboral pozisyonda yetişkin kesmek için seçti, ve aynı zamanda çünkü izin gözlem ve bütün vücudu basit morfolojik bileşenlerden yeniden birleştirilen nasıl moleküler analizleri.
Nematostella Rejenerasyon Evreleme Sistemi (NRSS), normal kültür koşulları altında, bir kesilmiş physa rejenerasyon herhangi bir yönü ilerleme skoru kullanılabilir morfolojik kriterler nispeten basit bir dizi içerir ya da deneysel olarak, örneğin küçük molekül tedavileri, genetik manipülasyon da durumları tedirgin veya çevresel değişiklik. Beklendiği gibi, NRSS rejenerasyon hücresel ve moleküler olayların başvurulabilir hangi bir morfolojik yapı iskelesi olarak benimsenmiştir hale gelmektedir10.
Nihayet kesim bizim yöntem yakın tarihli bir çalışmada 17 kullanılan pim nokta ponksiyon daha fazla büyüklükte bir gaping delik birkaç emir üretir, ancak her ikisi de yaralar 6 saat civarında iyileşir. yara kapatma görsel tutuklama ve farklı aşamalarını belgeleyen bir yaranın büyüklüğü ve kapatmak için gereken zaman belirgin bağımsızlığını açıklamaya deneysel yaklaşımlar önermek gerekir. Böylece, bu protokolü tarafından sağlanan aboral amputasyon sürecinin daha derin bir görsel anlayış, bu model rejenerasyon sistemi içine daha fazla soruşturma yardım ve Nematostella vectensis kullanarak bu evreleme sisteminin uygulanmasını genişletecek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yara iyileşmesi ve rejenerasyon bir model olarak Nematostella kullanımı giderek daha popüler hale gelmektedir. Nedenle, atanan ve mukayese edilebilir etkili hücresel ve moleküler analizler önce belirli bir protokol morfolojik kalıplarını görselleştirmek edebilmek için önemlidir. Hayatın sonrası Planula aşamalarında, hemen hemen her yerde ampute herhangi bir eksik yapısında reform edememek, rejeneratif "esneklik" yüksek derecede sahip Nematostella. Bu nedenle, çeşitli ar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma GHT bir New York Kök Hücre Bilim (NYSTEM C028107) Hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
| Glass Culture Dish, 250 ml | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 ml |
| Glass Culture Dish, 1,500 ml | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 ml |
| Polyethylene transfer pipette, 5ml | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
| Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
| Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
| #5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
| Pyrex petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass petri plates |
| Sterile 6 well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 12 well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 24 well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
| Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
| pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
| artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
| Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
| Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
| Beaker, Graduated, 4,000ml | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
| Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 – 40x magnification |
References
- Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. . Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley’s Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. , (1986).
- Trembley, A. . Mémoires pour servir à l’histoire d’un genre de polypes d’eau douce, à bras en forme de cornes. , (1744).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Galliot, B. Hydra, a fruitful model system for 270 years. Int J Dev Biol. 56 (6-8), 411-423 (2012).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles?. Dev Genes Evol. 233 (1-2), 53-66 (2013).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration?. Dev Dyn. 226 (2), 257-267 (2003).
- Amiel, A. R., et al. Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis. Int J Mol Sci. 16 (12), 28449-28471 (2015).
- Warren, C. R., et al. Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis. PLoS One. 10 (4), e0124578 (2015).
- Gong, Q., et al. Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis. Biol Bull. 227 (3), 211-220 (2014).
- Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis. Dev Dyn. 242 (11), 1320-1331 (2013).
- Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nat Protoc. 8 (5), 916-923 (2013).
- Tucker, R. P., et al. A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration. Biol Open. 2 (2), 217-226 (2013).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Dev Biol. 12, (2012).
- Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis. Dev Dyn. 240 (12), 2673-2679 (2011).
- Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (1), 104-108 (2010).
- Burton, P. M., Finnerty, J. R. Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 219 (2), 79-87 (2009).
- DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis. BMC Biol. 12, (2014).
- Hand, C., Uhlinger, K. R. Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis. Invert Biol. 114, 9-18 (1995).
- Fritzenwanker, J. H., Technau, U. Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa). Dev Genes Evol. 212 (2), 99-103 (2002).
- Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. Science’s super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry. The Science Teacher. 83 (3), 33-40 (2016).
- Genikhovich, G., Technau, U. In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).
- Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 215 (12), 618-630 (2005).
- Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system. Biosystems. 87 (2-3), 191-203 (2007).
- Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission. Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nat Commun. 5, 5486 (2014).
- Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis. Front Zool. 11, 44 (2014).
- Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1684), (2015).
- Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms. Development. 139 (2), 347-357 (2012).
- Richards, G. S., Rentzsch, F. Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis. Development. 141 (24), 4681-4689 (2014).
- DuBuc, T. Q., et al. In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes. BMC Cell Biol. 15, (2014).
- Kaur, J., Debnath, J. Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 461-472 (2015).
- Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis. Amino Acids. 47 (10), 2065-2088 (2015).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. Autophagy in stem and progenitor cells. Cell Mol Life Sci. 73 (3), 475-496 (2016).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9 (6), 830-849 (2013).
- Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging. Cell Mol Life Sci. 70 (1), 89-103 (2013).
- Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. Autophagy in zebrafish. Methods. 75, 172-180 (2015).
- Varga, M., et al. Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration. Cell Death Differ. 21 (4), 547-556 (2014).
- Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. Autophagy and apoptosis in planarians. Apoptosis. 15 (3), 279-292 (2010).
- Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra. Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).
- Tettamanti, G., et al. Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling. Curr Pharm Des. 14 (2), 116-125 (2008).
