Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.
צורבים, ובאופן ספציפי הידרה, היו הבעלים החיים הראשונים הראו להתחדש מבנים שניזוקו או נקטעים, ואכן מחקרים כאלה לטעון השיקו חקירה ביולוגית מודרנית דרך העבודה של Trembley לפני יותר 250 שנה. נכון להיום המחקר של התחדשות חלה התעוררות מחודשת הן באמצעות "קלאסיים" אורגניזמים רגנרטיבית, כגון הידרה, planaria ו Urodeles, כמו גם קשת הרחבת מינים פורש טווח של metazoa, מן ספוגים באמצעות יונקים. מלבד העניין המהותי שלה כתופעה ביולוגית, הבנה כיצד התחדשות עובדת במגוון מינים תרצינה להודיע לנו על האם תהליכי התחדשות לשתף תכונות משותפות ו / או מינים או בהקשר ספציפי מנגנונים תאיים ומולקולריים. כלנית הים כוכבנית, vectensis Nematostella, הוא אורגניזם מודל המתעוררים להתחדשות. כמו ההידרה, Nematostella הוא חבר של המערכה העתיקה, הצורבים, אבל בתוך tהוא בכיתה anthozoa, clade אחותו אל הידרתים כי הוא אבולוציונית יותר הבסיס. לכן היבטים של התחדשות Nematostella יהיו מעניינים להשוות לעומת עם אלה של ההידרה צורב אחרים. במאמר זה, אנו מציגים שיטה לחצות, להתבונן ולסווג התחדשות של סוף aboral של המבוגר Nematostella, אשר נקרא physa. Physa עובר ביקוע טבעי כאמצעי רבייה מינית, ואו ביקוע טבעי או קטיעה ידנית של physa מפעילה מחדש צמיחה הרפורמציה של מורפולוגיות מורכבות. כאן יש לנו קודיפיקציה שינויים מורפולוגיים פשוטים אלה בתוך מערכת Staging התחדשות Nematostella (להלן NRSS). אנו משתמשים NRSS כדי לבחון את ההשפעה של chloroquine, מעכב פונקציה ליזוזומלית שחוסמת autophagy. התוצאות מראות כי התחדשות של מבנים פוליפ, ובמיוחד mesenteries, הוא לא נורמלי כאשר autophagy מעוכבת.
התצפית של התחדשות ב הידרה יחיד הייתה האירוע המכונן כניסתו של ביולוגיה כמו 1,2 מדע ניסויי. ההתחדשות נשארת תופעה של משיכה רחבה באופן יוצא דופן כדי ביולוג ולהניח אדם כאחד. פוטנציאל ביולוגים התפתחותיים, קלינאים, מדענים ביו מהנדסים רקמות להבין ולהתגבר על המגבלות על התחדשות אדם עושה ביולוגית התחדשות יותר מעניין מהותי.
עכשיו, עם השימוש של טכנולוגיות מתפתחות כגון הגנום רצף רווח והפסד של כלי פונקציה, השדה צפוי ניסה להפריד מנגנון שיקום וכדי בסופו של דבר להבין כיצד שונה מינים יכול להתחדש בעוד שאחרים לא יכולים. מידת האחידות בתגובות מולקולריות, תאית מורפולוגיים נותרה הובהרה, אך עד כה נראה כי התגובות הבסיסיות בקרב בעלי חיים שיכולים להתחדש דומות יותר מאשר יצטרך Imagi היהנד רק לפני עשור 3.
צורב בפרט הם קלילים על התחדשות כמעט כל חלקי גופם בתוך קשת רחבה של גיוון מורפולוגיים. מתוך פוליפ מים הבודד הטרי, הדרתי יחד עם הפוליפים הימיים הזעירים לבנות שוניות אלמוגים עצומות, אל בסיפונופורים הקולוניאלי המורכב, כגון Man-O-המלחמה הפורטוגזית, התחדשות היא לעתים קרובות במצב של רבייה, בנוסף מנגנון תיקון או רפורמה חלקי גוף פגומים או אבד כתוצאה מפגיעה וטריפה. אם המינים השונים של צורבים להשתמש מנגנונים דומים או שונים להתחדשות היא שאלה מעניינת ביסודו 4-6.
אנחנו, ואחרים כבר בפיתוח anthozoan, Nematostella vectensis כמודל התחדשות 7-17. אנחנו לאחרונה פתחנו מערכת אחסון זמנית לתיאור התחדשות של גוף כולו מחתיכה אחידה מורפולוגית של רקמות נחצתה מן aboraסוף l של הפוליפ 10. בעוד פוליף Nematostella יכולים להתחדש כאשר נחצו ברמה כזו או אחרת, בחרנו לחתוך מבוגרים לעבר עמדת aboral באזור הפשוט ביותר מורפולוגית, את physa, בין שאר כי זה קרוב המטוס הרגיל של ביקוע מיני טבעי 18, וגם בגלל זה תצפית היתרים בניתוחים מולקולריים לאופן שבו גוף כולו מחדש מן הרכיבים מורפולוגיים הפשוטים.
מערכת staging התחדשות Nematostella (NRSS) מספקת מערכת פשוטה יחסי של מבחני ביצועים מורפולוגיים שיכול לשמש להבקיע את ההתקדמות של כל היבט של התחדשות ידי physa קטוע, בתנאי תרבות נורמלים או ניסיוני מוטרד מצבים כגון טיפולי מולקולה קטנים, מניפולציה גנטית , או שינוי סביבתי. כצפוי, NRSS הופכת אמצה כמו פיגום מורפולוגיים שעליו האירועים התאיים ומולקולריים של התחדשות יכולים להיות הופנה10.
לבסוף השיטה של חיתוך שלנו מייצרת הזמנות כמה חור שנפערו גודל גדול יותר לנקב סיכת נקודה בשימוש במחקר שנערך לאחרונה 17, עדיין הוא לרפא את הפצעים סביב 6 שעות. תיעוד השלב חזותי מעצר והמובחן של סגירת פצע צריכה להציע גישות ניסיוניות להסביר את העצמאות לכאורה של הגודל של פצע ואת הזמן שנדרש כדי לסגור. לפיכך, הבנה ויזואלית עמוקה יותר של תהליך קטיעת aboral, המסופקת על ידי פרוטוקול זה, תסייע חקירות נוספות לתוך מערכת התחדשות המודל הזה ולהרחיב את היישום של מערכת קביעת שלב זו באמצעות Nematostella vectensis.
שימוש Nematostella כמודל של ריפוי פצעים והתחדשות אהיה יותר ויותר פופולרי. לכן, חשוב להיות מסוגל לדמיין את דפוסי מורפולוגיים של פרוטוקול מסוים לפני ניתוחים תאיים ומולקולריים יעילים ניתן להקצות והשווה. Nematostella יש רמה גבוהה של "גמישות" משובים, יכולת לבצע רפורמה…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי תאי גזע ניו יורק למדע (NYSTEM C028107) מענק GHT.
Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
Glass Culture Dish, 250 ml | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 ml |
Glass Culture Dish, 1,500 ml | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 ml |
Polyethylene transfer pipette, 5ml | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
#5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
Pyrex petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass petri plates |
Sterile 6 well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
Sterile 12 well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
Sterile 24 well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
Beaker, Graduated, 4,000ml | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 – 40x magnification |