ניתוח מהיר של פנוטיפים היממה ארבידופסיס פרוטופלאסט טרנספקציה עם כתבת שעון פלורסנט
Summary
השעון הביולוגי מווסת כשליש של transcriptome ארבידופסיס, אך אחוז הגנים המזינים בחזרה מדידת זמן נותר עלום. כאן אנו להמחיש שיטה להעריך פנוטיפים יממה במהירות בכל קו מוטציה של ארבידופסיס באמצעות הדמיה זורחת של עיתונאי יממה הביע זמני ב פרוטופלאסט.
Abstract
The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.
Introduction
רוב היצורים החיים להחזיק שעון נוכחות אנדוגני כדי לסייע במשא ומתן יעיל של שינויים יומיים לסביבה. שעון נוכחות זה, השעון הביולוגי, מסדיר היבטים רבים של חילוף החומרים והפיזיולוגיה של אורגניזם לצפות שינויים צפויים בסביבה החיצונית. בצמחים למשל, לקראת התקפות הפתוגן או אוכלי עשב צפוי ובזמן בתוקף מפחית את הרגישות הכוללת 1 – 4. מטבוליזם עמילן מוסדר בחוזקה על ידי השעון הביולוגי על מנת להבטיח כי עתודות עמילן האחרון עד עלות השחר אם גדל בתנאי יום ארוך או קצר 5. ואכן, צמחים עם שעוני יממה התאמתו שיעורי צמיחה מוגברות סביבה 24 שעות מופע, שיעורי קיבוע פחמן ושיעורי הישרדות לעומת צמחים מפעיל שעון של תקופה תואמת 6. ההשפעה הנרחבת של מקצבי יממה בכל התהליכים הללו נובעת במידה רבה מן הרגולציה הקצבית של עד שליששל transcriptome הכולל ארבידופסיס 7. מוצרי גנים קצביים אלה מעורבים במגוון רחב של תהליכים תאיים כולל מסלולים מטבוליים, איתות הורמון, ותגובות לחץ 7. נוסף על כך, תקנת יממה ישירה של תפקוד חלבון היא הוקמה על ידי רגולצית יממה של זירחון 8 ו שלאחר translational שינויים אחרים ככל הנראה (PTMs).
במרכז השעון הביולוגי שמניע תכנות מחדש תעתיק יומי זה טמון רשת של תעתיק / משוב translational לולאות (TTFLs), כולל גנים הביע הבוקר היממה שעון מיזמים 1 (CCA1) ומאוחר מוארך HYPOCOTYL (LHY) כי לדכא את הביטוי עיתוי גנים הערב של הקבינה 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) ואת חברי מורכבים הערב (EC); LUX ARRHYTHMO (LUX), אפשרות הפריחה 3 (ELF3), ו ELF4 9 – 11. שנינות יחדh -genes וסת RESPONSE פסאודו (PRR3, 5, 7, ו -9), TOC1 מדחיק CCA1 / ביטוי LHY ואילו EC פועלת כרגולטור חיובי 12 – 14. נוספת למנגנוני משוב, שלאחר תעתיק ופוסט translational הסדרת מרכיבי רשת TTFL ממלאת תפקיד חשוב במקצב פעילות כוונון. נכון להיום, PTM הנפוץ ביותר שזוהה על חלבוני שעון ביולוגיים הוא זירחון 15. זירחון של CCA1 ידי קזאין קינאז 2 (CK2) משפיעה שלה מחייב למקד היזמים 16 והיא חשובה עבור פיצוי טמפרטורה של השעון הביולוגי 17. חלבוני PRR הם פוספורילציה דיפרנציאלי על מחזור היממה, ו זרחון של TOC1 משפיע אינטראקציה עם הרגולטור השלילי שלה, ZEITLUPE רכיב שעון בהדרגה-הערב (ZTL) 18. דוגמאות אלה ממחישות כיצד PTMs אינטראקציות חלבון-חלבון לכוון את רשת TTFL לתוך 24 שעותמתנד תעתיק. לקבלת מבוא מפורט יותר לרשת שעון התעתיק והרגולציה שלה, סקירות אחרונות מעולות זמינות (למשל התייחסות 15).
עם זאת, מה נשאר פחות ברור הוא המידה שבה תהליכים מוסדרים בקצב והיבטים אחרים של חילוף חומרים תאיים להאכיל חזרה לתוך מנגנון המדידה הזמן עצמו. הקרנה נרחבת של מוטציות ארבידופסיס למומי שעון יוכל לקבל הבנה נוספת מהם המנגנונים או מסלולי איתות יכולים להיות מעורבים ההדור של 24 מקצבי hr מרשת TTFL. לשם כך, קים סומרס שפורסמו בעבר שיטה פריצת דרך עבור ניתוח מהיר ויעיל של פונקציית השעון בכל קו ארבידופסיס 19. בהתבסס על השימוש בביטוי חולף פרוטופלאסט, מתודולוגיה זו עולה צורך הקווים מהונדסים יציבים או חוצת קווי סמן שעון זורחים. כאן, אנו לחזות isolatio פרוטופלאסט גבוהה מניבשיטת n 20 בשילוב עם פרוטוקול אופטימיזציה להקרין פגמי יממה על ידי הדמיה זורחת של סמני שעון הביעו זמני ב קורא צלחת 96-היטב.
נשווה ארבידופסיס wild-type col- 0 עד מוטנטים השעון היטב מאופיין כדי לאשר את המתודולוגיה המתוארת כאן בהצלחה מזהה מקצבי היממה שינו. פרוטופלאסט נגזר שורות אלו טרנספקציה עם לבנות כתב המבטא בלוציפראז גחלילית מן האמרגן CCA1 היממה; CCA1pro: 19 לוק. בלוציפראז מזרז את התגובה הרבה השלבים שבו luciferin מומר נרגשות אלקטרוני oxyluciferin פולט 21 אור, אשר צלם לאורך זמן כדי להעריך את התקופה, המשרעת והפאזה של מקצבי תעתיק פרוטופלאסט אלה.
הפרוטוקול מורכב משלושה חלקים עיקריים; לבודד את פרוטופלאסט, transfecting פרוטופלאסט עם הפלסמיד הכתב, ו- IM זורחהְזדַקְנוּת. אלה שלושה חלקים תמיד צריכות להתבצע ביום אחד, באמצעות מאגרים ריאגנטים וטריים. גידול צמחים וטיהור כמות מספקת של פלסמיד הכתב צריך להתבצע מראש ואינם דמיינו בפרוטוקול זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים assay מהיר למסך פגמי תקופת יממה בקווים ארבידופסיס, כוללים בידוד פרוטופלאסט, transfection, והדמית luminecent. תקופת יממת wild-type ארבידופסיס ושעון מוטציות cca1 / lhy, ztl, ו CCA1 -OX חושב ממדידות של הארה מתוך CCA1pro: כתב לוק ומצא להיות עקבי עם נתונים שפורסמו שנוצרו מצמחים שלמים באמצעות עוד פעם רב גישות מהונדסות (טבלה 2). שימוש assay זה להקרין מוטציות ארבידופסיס ימנע את הדרישה הראשונית כדי ליצור קווי זורח מהונדסים, אשר זה זמן רב עלולים רק חושף כי מוטציה מסוימת מפגין מקצבי wild-type. יתרון ברור של פרוטוקול זה הוא, שכל קו ארבידופסיס יכול להיות מוקרן בזמן קצר עבור מקצבי תעתיק יממה שינו, אשר יסייעו בזיהוי גנים המשפיעים יותר מדידת זמן בצמחים.
<p class= "Jove_content"> בידוד של פרוטופלאסט יכול להיות מייגע, במיוחד אם קו המוטציה מציג פנוטיפ מתגמד. דיווח בעבר שיטות להפקת פרוטופלאסט לערב חיתוך עלים או שתילים לרצועות דקות ואקום שחדר רצועות עם פתרון האנזים לאפשר אנזימים להגיע קירות התא 26,27. העיכול שלאחר מכן דורש לפחות דגירת hr 3 בחושך כדי לשחרר את פרוטופלאסט לתוך תמיסת האנזים. כאשר חדירת אבק אינה מוחלת, זמן דגירה עד 18 שעות מומלצות. בפרוטוקול המובא כאן, חדירת אבק היא מיותר כי שכבת תאי אפידרמיס בלתי חדירה האנזימים הוסרה על ידי קלטת. בעת יצירת פרוטופלאסט ידי חיתוך חומר צמחי יש צורך פרוטופלאסט נפרד מן ההריסות דופן התא לאחר עיכול; זה בדרך כלל נעשה על ידי סינון הפתרון או לטיהור אותו על 27,26 שיפוע סוכר. כאן, כל רקמה מעוכלת תישאר בקלטת החיטוי לאחרעיכול, כך טיהור שיפוע סינון וסוכר של פרוטופלאסט ניתן להשמיט. יש סיכוי כי הלחץ הנובע נהלים protoplasting ממושך משפיע על כדאיות התא ואת השעון הביולוגי. שיטת protoplasting הסרט המבוסס על 20 מדמיין כאן מניבה מספר גבוה של פרוטופלאסט; ובהינתן הכדאיות של תאים על פני סדרה עתית היממה ואת אורכי תקופת ההתאמה של פרוטופלאסט ושתילים כולו (לוח 2), המתודולוגיה המתוארת כאן עדיפה על פני שיטות חלופיות כדי ליצור פרוטופלאסט.צעד transfection של הפרוטוקול הוא שלב קריטי שמשפיע על יכולת הקיום של פרוטופלאסט. פתרון PEG מאפשר ה- DNA כדי להיות מועבר לתא, ושניהם זמן הדגירה בפתרון זה (שלב 3.4) ואחוז PEG צריך להיקבע באופן אמפירי. הריכוז הסטנדרטי הוא 20%, עם ריכוזים נמוכים הפחתת יעילות השינוי ומעלהריכוזי הפחתת כדאיות 28. זמן דגירה קצר ככל חמש דקות יכול להניב transfection היעיל של פרוטופלאסט 27.
פרוטופלאסט ניתן הדמיה על כל פלטפורמת הדמיה זורחת. בסרטון הזה, השתמשנו קורא צלחת הארה מצויד תאורה חיצונית (אדום נוריות כחולות, 630 ו 470 ננומטר, בהתאמה, בעצימות בשילוב של ~ 20 μE), אשר מאפשר הקרנת תפוקה גבוהה ומדידות תכופות. ציוד הדמיה אחר מאתר הארה, כגון קוראי צלחת חלופיים או setups מבוססים סביב מצלמת תשלום מצמידי מכשיר (CCD), יכול להיות מיושם באופן שווה גם כל עוד תאורה זמינה עבור פוטוסינתזה. היתרון של שימוש במצלמת CCD רכוב על ארון לשליטה הוא כי אור וטמפרטורה ניתן לתכנת. החיסרון הוא זמן ללכוד יותר, מציגה תקופות ממושכות של החושך שיכולים לגרום ללחץ על פרוטופלאסט בנוסף לטרודing מדידת זמן אנדוגני. לא משנה נבחר איזו פלטפורמה ניסיונית, התאמת הגדרות עשויה להיות נחוץ לעומת הגדרות עבור שתילים או צמחים בוגרים. מניסיוננו, הגדלה הריכוזית פלסמיד הכתב במהלך transfection ו / או luciferin למאגר ההדמיה עשויה לפתור כל מקצבים לא יציבים או במהירות ריסון שעלול להתרחש ניסויים ראשוניים.
בניסויים עתידיים, המתודולוגיה המתוארת כאן ניתן להחיל ללמוד את הפנוטיפ היממה של כל קו ארבידופסיס מוטציה. עם שינויים קלים, את ההשפעה של תרופות שונות כגון על מדידת זמן יכולה להיחקר התקנה זו. יתר על כן, transfection יכול להיות שונה כדי לכלול microRNA המלאכותי גן השתקת 19, נוסף בהרחבה הצדדית של פרוטוקול זה. פרוטוקולים ליצור פרוטופלאסט אורז ומבוססים 29 ופרוטוקול ההדמיה המוצג כאן יכול להיות מיושמים באופן שווה כדי לקדם u שלנוnderstanding של השעון בצמחי יבול monocot חשיבות כלכלית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).
Materials
| CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride | Merck Millipore | 219466 | |
| Pectinase R10 | Sigma Aldrich | P2401 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4503 | |
| MES | Acros Organics | 327765000 | |
| NaCl | Acros Organics | 327300010 | |
| Glucose | Fischer Scientific | G/0500/60 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | Acros Organics | 434630010 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| D-Luciferin, Firefly | Biosynth AG | L-8200 | Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9618 | |
| Comply Steam Indicator Tape | 3M | 1222 | |
| Magic Tape | 3M | 819-1460 | |
| Petri Dishes | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
| Microplate, 96 well, flat bottom, white | Greiner Bio-One | 655075 | |
| TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates | Perkin Elmer | 6050195 | |
| Syringe, 10 ml, w/o needle | BD Plastipak | 302188 | |
| Syringe filter 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) | Free download at amillar.org | ||
| QIAfilter Maxiprep Kit | Qiagen | 12262 | |
| Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell | Hawksley | AC6000 | |
| Bright field microscope | Optika Microscopes | B-150POL-B | |
| LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module | Berthold Technologies Ltd | 57947/57948 |
References
- Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).
- Zhang, C., et al. Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis. PLoS Pathog. 9 (6), 1003370 (2013).
- Hevia, M. A., Canessa, P., Müller-Esparza, H., Larrondo, L. F. A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).
- Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).
- Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).
- Dodd, A. N., et al. Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage. Science. 309 (5734), 630-633 (2005).
- Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development. Genome Biol. 9 (8), 130 (2008).
- Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways. Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).
- Mizoguchi, T., et al. LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis. Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).
- Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY. Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).
- Lu, S. X., et al. CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis. Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).
- Nakamichi, N., et al. PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).
- Dixon, L. E., et al. Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis. Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).
- Gendron, J. M., et al. Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).
- Hsu, P. Y., Harmer, S. L. Wheels within wheels: the plant circadian system. Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).
- Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).
- Portolés, S., Más, P. The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis. PLoS Genet. 6 (11), e1001201 (2010).
- Fujiwara, S., et al. Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins. J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).
- Kim, J., Somers, D. E. Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).
- Wu, F. -. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich – a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 16 (2009).
- Baldwin, T. O. Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains. Structure. 4 (3), 223-228 (1996).
- Edwards, K. D., et al. Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions. Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424 (2010).
- Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis. Cell. 101 (3), 319-329 (2000).
- Wang, Z. -. Y., Tobin, E. M. Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression. Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).
- Kim, W. -. Y., Geng, R., Somers, D. E. Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).
- Zhai, Z., Jung, H. -. I., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).
- Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts. Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).
- Zhang, Y., et al. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant Methods. 7 (1), 30 (2011).
