Farelerde Hızlandırılmış Ateroskleroz Indüksiyonu: "Tel-Yaralanma" Modeli
Summary
Bu çalışmada farelerde hızlandırılmış ateroskleroz indüksiyonu için invaziv bir prosedür açıklanmaktadır. Elektrik veya kriyo kaynaklı yaralanma yöntemi ile karşılaştırıldığında, mekanik kaynaklı yaralanma revaskülarizasyon tedavileri sonrası restenoz insan durumunu taklit eder ve ilgili moleküler mekanizmaların çalışması için idealdir.
Abstract
Ateroskleroz arterduvarında gelişen proliferatif fibro-inflamatuar bir hastalıktır, eksik bir kan akımı veya kan akımı eksikliği indükleyen. Ayrıca, kusurlu vasküler duvarın yırtılması ile, ateroskleroz oklüzif trombüs oluşumunu neden, hangi miyokard enfarktüsü veya inme ana nedeni ve ölüm en sık nedeni temsil eder. Kardiyovasküler alandaki gelişmelere rağmen, birçok soru cevapsız kalır ve ek temel araştırma ateroskleroz sırasında moleküler mekanizmaları ve etkileri anlayışımızı geliştirmek için gereklidir. Sınırlı klinik çalışmalar nedeniyle, stent implantasyonu sonrası neointima oluşumu, balon anjiyoplasti veya endarterektomi gibi aterosklerotik koşulları yeniden yaratan temsili hayvan modellerine ihtiyaç vardır. Fare birçok avantaj sunduğundan ve moleküler süreçleri incelemek için en sık kullanılan model olduğundan, mevcut çalışma da tel-yaralanma modeli olarak bilinen endotel denudasyonu invaziv bir prosedür öneriyor, hangi revaskülarizasyon prosedürleri sonra arterlerde neointima oluşumuinsan durumunu temsil eden.
Introduction
Ateroskleroz miyokard enfarktüsü veya inme gibi kardiyovasküler olayların altında yatan ana patolojidir. Akut kardiyovasküler sendromları tetikleyen başlıca mekanizmalar plak rüptürü, yüzeyel erozyon ve trombüs oluşumudur. Plak gelişimine bağlı birden fazla klinik durum vardır: yerli aterosklerotik plak, endarterektomi sonrası restendoz, ve stentimplantasyonuolmayan balon anjiyoplasti sonrası restenoz1 . Arteriyel yaralanma dan sonra, inflamatuar süreçlerin bastırılması2,3 ve endotel kompartman kurtarma daha fazla komplikasyonları önlemek için gereklidir1. Klinik araştırmalar, etik hususlar, maliyetler ve temel mekanizmalarda bilgi eksikliği nedeniyle doku ve kan örnekleri ile sınırlıdır. Bu nedenlerden dolayı, klinik koşulları yeniden oluşturabilen4-6hayvan modellerinde moleküler mekanizmaların incelenmesi ne gerek vardır. Ateroskleroz bağlamında hızlandırılmış neointima oluşumu modelimiz bu modellerin küçük hayvanlarda uygulanmasında uzun yıllara ait deneyimin bir sonucudur7-11. Fare modeli araştırma için en cazip modeldir, kullanım kolaylığı nedeniyle, hayvan satın alma ve bakım ile ilgili düşük maliyetler nedeniyle büyük hayvan grupları na sahip olma yeteneği, ve çeşitli transgenik ve nakavt suşları durumu.
Fare modelinin en büyük dezavantajı aterosklerotik hastalığa maruz ana arterlerin küçük boyutudur (karotis arter, aort, ve femoral arter), hangi damarları işlemek ve invaziv bir aterosklerotik plak neden nitelikli cerrahi uzmanlık ve beceri gerektirir. Bu nedenle, endarterektomi veya stent implantasyonu sonrası restenoz bağlamında hızlandırılmış neointima oluşumu modeli, bu yazıda önerilen bir adım-adım kılavuz ve öneriler ilgilenen personel için giriş kolaylaştırmak için sunulmaktadır. Bir diğer dezavantajı da denudasyonun normal arter duvarında yapılmasıdır ve bu nedenle neo-intima oluşumu klinik duruma göre orta olacaktır. Apolipoprotein E nakavt(Apoe-/-) yüksek yağ diyeti ile beslenen farelerde ulaşılan plazma kolesterol düzeyi neo-intima oluşumu için gerekli uygun bir pro-inflamatuar ortam oluşturur.
Ameliyat stereomikroskop altında yapılır. Karotis arter ventral servikal bölgede bir median insizyon tarafından maruz kalır. Karotis arterin üstündeki ve çevresindeki anatomik yapılar cerrahi sonrası iltihabı azaltmak için minimal manipüle edilir. Karotis arter bifurkasyonu maruz kalır. Hızlandırılmış neointima oluşumunu indüklemek için, iç ve dış karotis arterler kan akımı nın kesilmesi ve sonraki ortak karotis arter denudasyonu için hazırlanır. Sonuç olarak, bu yöntem hayvan ameliyatlarında en az deneyime sahip personel tarafından öğrenilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, hayvan ameliyatlarında en az deneyime sahip personel tarafından bile tel yaralanması prosedürünün gerçekleģtirimi için yararlı ipuçları sayılmıĢtır. Bu prosedürü gerçekleştirmede iki kritik adım vardır: dış karotis arter insizyonu ve tel insidansı. Dış karotis arterindeki kesi, yeterli kalan malzemeyi sağlamak için çatallanmadan mümkün olduğunca uzak tutulmalıdır (Şekil 1C). Kesi, tüm damarın kesme riski nedeniyle çok büyük olmamalıdır. İkinci kritik adım arteriyotomi sırasında kanama riski yüksek ve kan akışı verimli bir şekilde kesilmezse kılavuz tel insifi. Ayrıca lümen damarına kılavuz tel düzgün bir şekilde kullanılmazsa endotel denudasyonu gerçekleşmeyebilir veya arteriyel rüptür mümkündür. Bunu önlemek için kılavuz telin yüzeyi işlemden önce dikkatlice parlatılmalıdır.
Protokolü optimize etmek için, fare kafası ile ameliyat masasının cerraha doğru konumu, uygun kılavuz tel manipülasyonu için daha iyi bir görünüm, erişilebilirlik ve kontrol sağlar. Ayrıca, tekrarlanabilirliği artırmak için, tüm çalışmalarda aynı kılavuz tel kullanın. Tel boyutu değişmediğinden, bir çalışmada yer alan tüm fareler için aynı cinsiyet, yaş ve ağırlık kullanılarak fareler arasındaki tüm olası farklılıkları göz önünde bulundurmak ve ortadan kaldırmak önemlidir. Bundan sonra, Evans-Mavi boyama cerrah denudation verimliliğini belirlemede yardımcı olacaktır. Uygun ekipmanın varlığı prosedürün başarısı için bir ön koşuldur. Bu prosedürü gerçekleştirmek için 10X stereomikroskop gereklidir. Kılavuz telin uygun hazırlanması (örneğin parlatma) çok önemlidir. Bu nedenle, kılavuz tel hazırlamanın mevcut olduğu durumlarda uzman teknik personel tarafından yapılmasını önemle tavsiye ediyoruz.
Bu protokolde birçok sorun giderme adımı vardır. Eğer çatallanma yakın dış karotis arter kesici, dikkatle externa bağlamak, çatallanma yakın, bu yüzden kanama oluşur. Kesim sırasında dış karotis arter görülemez. Bu nedenle, ipek dikiş düzeyinde çatallanma düşünün. İpek sütür kaybolduğunda bölümleri toplayın. Dış karotis arterindeki kesi çok büyükse ve damar yırtılmışsa, karotis komünsine ve internal karotis artere giden kan akışının etkin bir şekilde kesildiğinden emin olun ve forceps kullanarak damarın açılmasını bulmaya çalışın. Kılavuz teli tanıttıktan ve denudation yaptıktan sonra, çatallanma yakın gemi bağla. Kesme sırasında, dikiş ipek kaybolmaya başladığında toplamaya başlar. Kılavuz tel ile denudasyon sırasında arteriyel yırtık meydana gelirse, kılavuz tel düzgün parlatılmış olup olmadığını mikroskop altında kontrol edin.
Tel yaralanma modelinin klinik durumlara benzerliğine rağmen, birçok grup farelerde yerli ateroskleroz aodaklanmıştır, ya da küçük hayvan ameliyatları gerçekleştirebilir eğitimli personel eksikliği nedeniyle, sıçan veya tavşan balon anjiyoplasti gibi invaziv ateroskleroz indüksiyonları seçin. Tavşan/sıçan kullanmanın faydalarına rağmen, örneğin minyatür ekipmanlara gerek olmamasına rağmen, ne fare modelleri ne de tavşan modelleri, neointima büyümesi ve stent trombozlarında yer alan moleküler mekanizmaların incelenmesi açısından farklı nakavt suşları sunmaktadır.
Farelerde stent içi restenoz eğitimi için mevcut modeller zordur, yüksek cerrahi beceriler gerektirir ve kanama veya felç gibi komplikasyonların yüksek riskleri vardır. Örneğin, femoral arter yoluyla torasik aort içine mekanik yaralanma veya stent-implantasyon yüksek mortalite oranı (% 35) eşlik arka bacak felci veya kanamanedeniyle 13-15. Ayrıca bir farenin karotis arterinde stent implantasyonu tarif16. Yordam benzer; ancak, analiz için doku işleme karmaşık ve tüm laboratuvarlar16için mevcut değildir. Karotis arter doğrudan erişilebilir, sadece operasyon prosedürleri için değil, aynı zamanda ultrason görüntüleme gibi mevcut görüntüleme yöntemleri için. Farelerde karotis arterlerde diğer yaralanma indüksiyonları elektrikli cihazlar kullanılarak yapılabilir17. Bu yöntemin gerçeklemesi kolaydır ve yüksek tekrarlanabilirlik sağlar. Ancak, mekanik yaralanma ile aynı değildir tüm damar katmanları, yaralanmaya neden olur. Balon uygulamalarının faydaları vardır, örneğin klinik uygulama doğrultusunda damar çapına ayar ve patolojik sonuç üzerinde güçlü etkisi vardır. Fare balonları mevcut olsa da, çok pahalıdır lar ve bu nedenle yaygın olarak kullanılmazlar. Bunun yerine, tel yaralanması in-stent darlığı taklit, kurulan yöntemdir.
Denudasyon normal arterduvarında yapılır, aterosklerotik arka plan ile olsa. Bu nedenle, neointima oluşumu klinik duruma göre orta olacaktır. Klinik öncesi modellerin yüksek sayıda, modellerin hiçbirinin insanlarda patofizyolojiye yol açan hücresel ve moleküler mekanizmaların tamamını ortaya çıkarmak için gerekli tüm kriterleri karşılayamamış olduğunu göstermektedir (bkz. Tablo 2).
Tel-yaralanma prosedürü uygulandıktan sonra, ateroskleroz için yeni tedavi stratejileri geliştirmek için tedavi hedefleri olarak kullanılabilecek hücreler, proteinler, mRNA’lar, mikroRNA’lar, genler veya diğer biyobelirteçleri tanımlamak için ve özellikle vasküler yaralanma sonrası neointima oluşumunda başka biyolojik ve moleküler analizler yapılabilir. Varsa, plak büyüme yüksek frekanslı ultrason veya diğer yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri kullanılarak izlenebilir. Ayrıca, bu tekniğin ustalaşması operatöre protokolü yaka yerleşimi, kısmi ligasyon ve hatta stent implantasyonu gibi diğer invaziv ateroskleroz indükleme modellerine uyarlama fırsatı verecektir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, RWTH Aachen Üniversitesi Tıp Fakültesi bünyesinde disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi IZKF Aachen (E.A.L.’ye küçük araştırma grubu) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Bayan Roya Soltan’a immünohistokimya lekelenmelerine yardım ettiği için teşekkür ederiz.
Materials
| Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | – |
| Forceps | FST, Germany | 91197-00 | standard tip curved 0,17 mm |
| Hemostat forceps | FST, Germany | 13007-12 | curved |
| Scissors | FST, Germany | 91460-11 | Straight |
| Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | – |
| Retractors | FST, Germany | 18200-10 | 2.5mm wide |
| Retractors | FST, Germany | 18200-11 | 5mm wide |
| Ketamine 10% | CEVA, Germany | – | – |
| Xylazine 2% | Medistar, Germany | – | – |
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | – | – |
| Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custom-made product | diameter 500µm, |
| section thickness 100 µm, | |||
| polytetrafluorethylene catheter | |||
| PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle |
| 7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | – |
| Michel Suture Clips | FST, Germany | 12040-01 | - |
| Clip Applying Forcep | FST, Germany | 12018-12 | - |
| 14”Wire for Catheter | Abbot | 1000462H | Use 10 cm from stiff part and equalize the ends |
| Mice | Charles River | Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background | - |
References
- Simsekyilmaz, S., Liehn, E. A., Militaru, C., Vogt, F. Progress in interventional cardiology: challenges for the future. Thromb Haemost. 113 (3), 464-472 (2015).
- Kubo, N., McCurdy, S., Boisvert, W. A. Defective Fas Expression on Bone Marrow Derived Cells Alters Atherosclerotic Plaque Morphology in Hyperlipidemic Mice. Discoveries. 3 (1), e37 (2015).
- Saffarzadeh, M., et al. Characterization of rapid neutrophil extracellular trap formation and its cooperation with phagocytosis in human neutrophils. Discoveries. 2 (2), e19 (2014).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. Mouse model of arterial injury. Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).
- Schwartz, R. S., et al. Preclinical evaluation of drug-eluting stents for peripheral applications: recommendations from an expert consensus group. Circulation. 110 (16), 2498-2505 (2004).
- Schwartz, R. S., et al. Restenosis and the proportional neointimal response to coronary artery injury: results in a porcine model. J Am Coll Cardiol. 19 (2), 267-274 (1992).
- Curaj, A., et al. Noninvasive molecular ultrasound monitoring of vessel healing after intravascular surgical procedures in a preclinical setup. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1366-1373 (2015).
- Liehn, E. A., Schober, A., Weber, C. Blockade of keratinocyte-derived chemokine inhibits endothelial recovery and enhances plaque formation after arterial injury in ApoE-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (10), 1891-1896 (2004).
- Liehn, E. A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C. Chemokines: inflammatory mediators of atherosclerosis. Arch Physiol Biochem. 112 (4-5), 229-238 (2006).
- Simsekyilmaz, S., et al. Role of extracellular RNA in atherosclerotic plaque formation in mice. Circulation. 129 (5), 598-606 (2014).
- Wu, Z., et al. Rhodamine-loaded intercellular adhesion molecule-1-targeted microbubbles for dual-modality imaging under controlled shear stresses. Circ Cardiovasc Imaging. 6 (6), 974-981 (2013).
- Schober, A., et al. Crucial role of the CCL2/CCR2 axis in neointimal hyperplasia after arterial injury in hyperlipidemic mice involves early monocyte recruitment and CCL2 presentation on platelets. Circ Res. 95 (11), 1125-1133 (2004).
- Ali, Z. A., et al. Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 833-840 (2007).
- Chamberlain, J., et al. A novel mouse model of in situ stenting. Cardiovasc Res. 85, 38-44 (2010).
- Rodriguez-Menocal, L., et al. A novel mouse model of in-stent restenosis. Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).
- Simsekyilmaz, S., et al. A murine model of stent implantation in the carotid artery for the study of restenosis. J Vis Exp. , e50233 (2013).
- Schroder, K., et al. NADPH oxidase Nox2 is required for hypoxia-induced mobilization of endothelial progenitor cells. Circ Res. 105 (6), 537-544 (2009).
