Induzione di aterosclerosi accelerata nei topi: il modello "Wire-Injury"
Summary
Questo studio descrive una procedura invasiva per l’induzione dell’aterosclerosi accelerata nei topi. Rispetto ad altri metodi che utilizzano lesioni indotte da elettricità o crioindotti, la lesione indotta dalla meccanica imita la condizione umana di mentonosi dopo le terapie di revascolazione ed è ideale per lo studio dei meccanismi molecolari coinvolti.
Abstract
L’aterosclerosi è una malattia fibro-infiammatoria proliferotale che si sviluppa nella parete arteriosa, inducendo un flusso sanguigno carente o una mancanza di flusso sanguigno. Inoltre, con la rottura della parete vascolare difettosa, l’aterosclerosi induce la formazione di trombo occlusivo, che rappresenta la causa principale dell’infarto o dell’ictus miocardico e la causa più frequente di morte. Nonostante i progressi nel campo cardiovascolare, molte domande rimangono senza risposta, e ulteriori ricerche di base sono essenziali per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi molecolari durante l’aterosclerosi e i suoi effetti. A causa di studi clinici limitati, vi è la necessità di modelli animali rappresentativi che ricreano condizioni aterosclerotiche come la formazione di neointima dopo l’impianto di stent, l’angioplastica a palloncino o l’endarterectomia. Poiché il topo presenta molti vantaggi ed è il modello più utilizzato per studiare i processi molecolari, lo studio attuale propone una procedura invasiva di denudazione endoteliale, nota anche come modello wire-injury, che è rappresentativa della condizione umana della formazione neointima nelle arterie dopo le procedure di revascolazione.
Introduction
L’aterosclerosi è la principale patologia alla base di eventi cardiovascolari come l’infarto miocardico o l’ictus. I principali meccanismi che innescano sindromi cardiovascolari acute sono la rottura della placca, l’erosione superficiale e la formazione di trombo. Ci sono molteplici situazioni cliniche legate allo sviluppo della placca: placca aterosclerotica nativa, restenosi dopo endarterectomia e restenosi dopo angioplastica a palloncino con/senza impianto stent1. Dopo la lesione arteriosa, la soppressionedei processi infiammatori 2,3 e il recupero del compartimento endoteliale sono essenziali per prevenire ulteriori complicazioni1. La ricerca clinica è limitata ai campioni di tessuti e sangue a causa di considerazioni etiche, costi, e una mancanza di conoscenza nei meccanismi di base. Per questi motivi, è necessario studiare i meccanismi molecolari nei modelli animali4-6, che possono ricreare le condizioni cliniche. Il nostro modello di formazione accelerata di neointima nel contesto dell’aterosclerosi è il risultato di molti anni di esperienza nella realizzazione di questi modelli in piccolianimali 7-11. Il modello murino è il modello più attraente per la ricerca, grazie alla sua facilità di manipolazione, alla capacità di avere grandi gruppi di animali a causa dei bassi costi legati all’acquisto e alla cura degli animali e alla disponibilità di vari ceppi transgenici e da urlo.
Lo svantaggio principale del modello murino è la piccola dimensione delle arterie principali sottoposte a malattia aterosclerotica (l’arteria carotide, l’aorta e l’arteria femorale), che richiede competenze chirurgiche qualificate e competenze per manipolare i vasi e indurre in modo invasivo una placca aterosclerotica. Pertanto, il modello di formazione accelerata di neointima, nel contesto della restenosi dopo l’endarterectomia o l’impianto di stent, proposto in questo documento è presentato con una linea guida passo-passo e suggerimenti per facilitare l’introduzione per il personale interessato. Un altro svantaggio è che la denudazione è fatta sulla normale parete arteriosa, e quindi, la formazione neo-intima sarà moderata rispetto alla situazione clinica. L’alto livello di colesterolo plasmatico raggiunto nei topi apolipoproteina E knockout (Apoe-/-) alimentati con un’alta dieta grassa crea un ambiente pro-infiammatorio adeguato necessario per la formazione neo-intima.
L’intervento viene eseguito sotto stereomicroscopio. L’arteria carotidea è esposta da un’incisione mediana nella zona cervicale ventrale. Le strutture anatomiche sopra e intorno all’arteria carotide sono minimamente manipolate per ridurre l’infiammazione post-chirurgica. La biforcazione dell’arteria carotide è esposta. Per indurre la formazione accelerata di neointima, le arterie carotide interne ed esterne vengono preparate per la cessazione del flusso sanguigno e la successiva denudazione dell’arteria carotidea. In conclusione, il metodo può essere appreso dal personale con una minima esperienza negli interventi chirurgici sugli animali.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo documento, forniamo consigli utili per eseguire la procedura di lesioni del filo anche da parte del personale con una minima esperienza negli interventi chirurgici sugli animali. Ci sono due passaggi critici nell’esecuzione di questa procedura: l’incisione dell’arteria carotide esterna e l’inserimento del filo. L’incisione nell’arteria carotide esterna deve essere eseguita il più lontano possibile dalla biforcazione, al fine di garantire abbastanza materiale rimanente (Figura 1C). L’incisione non deve essere troppo grande, a causa del rischio di tagliare l’intero recipiente. Il secondo passo critico è l’alto rischio di sanguinamento durante l’arteriotomia e l’inserimento del filo guida se il flusso sanguigno non viene interrotto in modo efficiente. Inoltre, la denudazione endoteliale potrebbe non avvenire o la rottura arteriosa è possibile se il filo guida non viene introdotto correttamente nel vaso di lume. Per evitare questo, la superficie del filo guida deve essere lucidata con attenzione prima dell’operazione.
Per ottimizzare il protocollo, la posizione del tavolo operatorio con la testa del mouse verso il chirurgo garantisce una migliore visione, accessibilità e controllo per la corretta manipolazione del filo guida. Inoltre, per aumentare la riproducibilità, utilizzare lo stesso filo guida in tutti gli studi. Poiché la dimensione del filo non cambia, è importante considerare ed eliminare tutte le possibili differenze tra i topi utilizzando lo stesso sesso, età e peso per tutti i topi inclusi in uno studio. Successivamente, la colorazione Evans-Blue aiuterà il chirurgo a determinare l’efficienza della denudazione. L’esistenza di attrezzature adeguate è un prerequisito per il successo della procedura. Uno stereomicroscopio 10X è essenziale per eseguire questa procedura. La corretta preparazione del filo guida (ad esempio lucidarlo) è fondamentale. Pertanto, si consiglia vivamente che la preparazione del filo guida sia eseguita da personale tecnico specializzato, ove disponibile.
In questo protocollo sono disponibili molti passaggi per la risoluzione dei problemi. Se si increderà l’arteria carotide esterna vicino alla biforcazione, legare con attenzione l’externa, vicino alla biforcazione, in modo che non si verifichi alcun sanguinamento. Durante il taglio, l’arteria carotide esterna non può essere vista. Pertanto, considerare la biforcazione a livello di sutura di seta. Raccogliere sezioni quando la sutura di seta scompare. Se l’incisione nell’arteria carotide esterna è troppo grande e il vaso è rotto, assicurarsi che il flusso sanguigno nei communi della carotide e nell’arteria carotide interna sia effettivamente interrotto e cercare di trovare l’apertura del vaso utilizzando le forcette. Dopo aver introdotto il filo guida ed eseguito la denudazione, legare il vaso vicino alla biforcazione. Durante il taglio, iniziare a raccogliere quando la seta dalla sutura inizia a scomparire. Se la rottura arteriosa si verifica durante la denudazione con il filo guida, controllare al microscopio se il filo guida è correttamente lucidato.
Nonostante la somiglianza del modello wire-injury alle situazioni cliniche, molti gruppi si concentrano sull’aterosclerosi nativa nei topi, o scelgono induzioni invasive di aterosclerosi, come l’angioplastica a palloncino nei ratti o nei conigli, a causa della mancanza di personale addestrato in grado di eseguire piccoli interventi chirurgici animali. Nonostante i vantaggi dell’uso di conigli/ratti, ad esempio senza bisogno di attrezzature miniaturizzate, né i modelli di ratti né i modelli di coniglio offrono una varietà di diversi ceppi knock-out, in termini di studio dei meccanismi molecolari coinvolti nella crescita della neointima e nella trombosi in-stent.
I modelli esistenti per studiare la restenosi in-stent nei topi sono difficili, richiedono elevate abilità chirurgiche e hanno elevati rischi di complicanze come sanguinamento o paralisi. Ad esempio, la lesione meccanica o l’impianto di stent nell’aorta toracica tramite arteria femorale è accompagnata da un alto tasso di mortalità (35%) a causa della paralisi della gamba posteriore osanguinamento 13-15. Descriviamo anche l’impianto di stent nell’arteria carotidea di untopo 16. La procedura è simile; tuttavia, l’elaborazione del tessuto per l’analisi è complicata e non è disponibile per tutti ilaboratori 16. L’arteria carotidea è direttamente accessibile, non solo per le procedure operative, ma anche per i metodi di imaging esistenti come l’imaging ad ultrasuoni. Altre induzioni di lesioni nelle arterie carotidee nei topi possono essere fatte utilizzando dispositivi elettrici17. Questo metodo è facile da eseguire e garantisce un’elevata riproducibilità. Tuttavia, induce lesioni in tutti gli strati del vaso, che non è identico a lesioni meccaniche. Le applicazioni di palloncini hanno benefici, ad esempio la regolazione del diametro del recipiente in linea con la pratica clinica e hanno una forte influenza sull’esito patologico. Anche se i palloncini del mouse sono disponibili, sono molto costosi e quindi non ampiamente utilizzati. Invece, il wire-lesione è il metodo stabilito, imitando stenosi in-stent.
La denudazione viene eseguita sulla normale parete arteriosa, anche se con uno sfondo aterosclerotico. Pertanto, la formazione di neointima sarà moderata rispetto alla situazione clinica. L’elevato numero di modelli preclinici dimostra che nessuno dei modelli soddisfa tutti i criteri necessari per scoprire l’insieme dei meccanismi cellulari e molecolari che portano alla fisiofisiologia nell’uomo (c’è la tabella 2).
Dopo aver eseguito la procedura di lesione del filo, è possibile eseguire altre analisi biologiche e molecolari per identificare cellule, proteine, mRNA, microRNA, geni o altri biomarcatori, che possono essere utilizzati come bersagli terapeutici per sviluppare nuove strategie di trattamento per l’aterosclerosi, e in particolare per la formazione di neointima dopo lesioni vascolari. Se disponibile, la crescita della placca può essere monitorata utilizzando ultrasuoni ad alta frequenza o altre tecniche di imaging ad alta risoluzione. Inoltre, padroneggiare questa tecnica darebbe all’operatore l’opportunità di adattare il protocollo ad altri modelli di incentivazione dell’aterosclerosi invasiva, come il posizionamento del collare, la legatura parziale o persino l’impianto di stent.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica I-KF Aachen (gruppo di ricerca junior a E.A.L.) all’interno della facoltà di Medicina presso l’Università RWTH Aachen. Ringraziamo anche la signora Roya Soltan per l’aiuto con la colorazione immunostochimica.
Materials
| Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | – |
| Forceps | FST, Germany | 91197-00 | standard tip curved 0,17 mm |
| Hemostat forceps | FST, Germany | 13007-12 | curved |
| Scissors | FST, Germany | 91460-11 | Straight |
| Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | – |
| Retractors | FST, Germany | 18200-10 | 2.5mm wide |
| Retractors | FST, Germany | 18200-11 | 5mm wide |
| Ketamine 10% | CEVA, Germany | – | – |
| Xylazine 2% | Medistar, Germany | – | – |
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | – | – |
| Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custom-made product | diameter 500µm, |
| section thickness 100 µm, | |||
| polytetrafluorethylene catheter | |||
| PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle |
| 7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | – |
| Michel Suture Clips | FST, Germany | 12040-01 | - |
| Clip Applying Forcep | FST, Germany | 12018-12 | - |
| 14”Wire for Catheter | Abbot | 1000462H | Use 10 cm from stiff part and equalize the ends |
| Mice | Charles River | Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background | - |
References
- Simsekyilmaz, S., Liehn, E. A., Militaru, C., Vogt, F. Progress in interventional cardiology: challenges for the future. Thromb Haemost. 113 (3), 464-472 (2015).
- Kubo, N., McCurdy, S., Boisvert, W. A. Defective Fas Expression on Bone Marrow Derived Cells Alters Atherosclerotic Plaque Morphology in Hyperlipidemic Mice. Discoveries. 3 (1), e37 (2015).
- Saffarzadeh, M., et al. Characterization of rapid neutrophil extracellular trap formation and its cooperation with phagocytosis in human neutrophils. Discoveries. 2 (2), e19 (2014).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. Mouse model of arterial injury. Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).
- Schwartz, R. S., et al. Preclinical evaluation of drug-eluting stents for peripheral applications: recommendations from an expert consensus group. Circulation. 110 (16), 2498-2505 (2004).
- Schwartz, R. S., et al. Restenosis and the proportional neointimal response to coronary artery injury: results in a porcine model. J Am Coll Cardiol. 19 (2), 267-274 (1992).
- Curaj, A., et al. Noninvasive molecular ultrasound monitoring of vessel healing after intravascular surgical procedures in a preclinical setup. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1366-1373 (2015).
- Liehn, E. A., Schober, A., Weber, C. Blockade of keratinocyte-derived chemokine inhibits endothelial recovery and enhances plaque formation after arterial injury in ApoE-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (10), 1891-1896 (2004).
- Liehn, E. A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C. Chemokines: inflammatory mediators of atherosclerosis. Arch Physiol Biochem. 112 (4-5), 229-238 (2006).
- Simsekyilmaz, S., et al. Role of extracellular RNA in atherosclerotic plaque formation in mice. Circulation. 129 (5), 598-606 (2014).
- Wu, Z., et al. Rhodamine-loaded intercellular adhesion molecule-1-targeted microbubbles for dual-modality imaging under controlled shear stresses. Circ Cardiovasc Imaging. 6 (6), 974-981 (2013).
- Schober, A., et al. Crucial role of the CCL2/CCR2 axis in neointimal hyperplasia after arterial injury in hyperlipidemic mice involves early monocyte recruitment and CCL2 presentation on platelets. Circ Res. 95 (11), 1125-1133 (2004).
- Ali, Z. A., et al. Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 833-840 (2007).
- Chamberlain, J., et al. A novel mouse model of in situ stenting. Cardiovasc Res. 85, 38-44 (2010).
- Rodriguez-Menocal, L., et al. A novel mouse model of in-stent restenosis. Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).
- Simsekyilmaz, S., et al. A murine model of stent implantation in the carotid artery for the study of restenosis. J Vis Exp. , e50233 (2013).
- Schroder, K., et al. NADPH oxidase Nox2 is required for hypoxia-induced mobilization of endothelial progenitor cells. Circ Res. 105 (6), 537-544 (2009).
