Inducción de la Aterosclerosis Acelerada en Ratones: El Modelo de "Lesiones por Alambre"
Summary
Este estudio describe un procedimiento invasivo para la inducción de la aterosclerosis acelerada en ratones. En comparación con otros métodos que utilizan lesiones inducidas por electricidad o crio, la lesión inducida por la mecánica imita la condición humana de la restenosis después de las terapias de revascularización y es ideal para el estudio de los mecanismos moleculares involucrados.
Abstract
La aterosclerosis es una enfermedad fibroinflamatoria proliferativa que se desarrolla en la pared arterial, lo que induce un flujo sanguíneo deficiente o una falta de flujo sanguíneo. Además, por ruptura de la pared vascular defectuosa, la aterosclerosis induce la formación oclusiva de trombos, que representa la principal causa de infarto de miocardio o accidente cerebrovascular y la causa más frecuente de muerte. A pesar de los avances en el campo cardiovascular, muchas preguntas siguen sin respuesta, y la investigación básica adicional es esencial para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos moleculares durante la aterosclerosis y sus efectos. Debido a estudios clínicos limitados, es necesario crear modelos animales representativos que recrean afecciones ateroscleróticas como la formación de neointima después de la implantación de stent, la angioplastia con balón o la endarterectomía. Dado que el ratón presenta muchas ventajas y es el modelo más utilizado para el estudio de los procesos moleculares, el estudio actual propone un procedimiento invasivo de denudación endotelial, también conocido como el modelo de lesión de alambre, que es representativo de la condición humana de la formación neointima en las arterias después de los procedimientos de revascularización.
Introduction
La aterosclerosis es la principal patología subyacente a eventos cardiovasculares como el infarto de miocardio o el accidente cerebrovascular. Los principales mecanismos que desencadenan los síndromes cardiovasculares agudos son la ruptura de la placa, la erosión superficial y la formación de trombos. Existen múltiples situaciones clínicas relacionadas con el desarrollo de la placa: placa aterosclerótica nativa, restenosis después de la endarterectomía, y restenosis después de la angioplastia con balón con/sin implantación de stent1. Después de la lesión arterial, la supresión de los procesos inflamatorios2,3 y la recuperación del compartimento endotelial son esenciales para prevenir complicaciones adicionales1. La investigación clínica se limita a las muestras de tejido y sangre debido a consideraciones éticas, costos y falta de conocimiento en los mecanismos básicos. Por estas razones, es necesario estudiar los mecanismos moleculares en los modelos animales4-6,que pueden recrear las condiciones clínicas. Nuestro modelo de formación de neointima acelerada en el contexto de la aterosclerosis es el resultado de muchos años de experiencia en la implementación de estos modelos en animales pequeños7-11. El modelo de ratón es el modelo más atractivo para la investigación, debido a su facilidad de manejo, la capacidad de tener grandes grupos de animales debido a los bajos costos relacionados con la compra y el cuidado de animales, y la disponibilidad de varias cepas transgénicas y eliminatorias.
La principal desventaja del modelo de ratón es el pequeño tamaño de las arterias principales sometidas a enfermedad aterosclerótica (la arteria carótida, la aorta y la arteria femoral), que requiere experiencia quirúrgica calificada y habilidades para manipular los vasos e inducir invasivamente una placa aterosclerótica. Por lo tanto, el modelo de formación acelerada de neointima, en el contexto de la restenosis después de la enrectomía o la implantación de stent, propuesto en este documento se presenta con una guía paso a paso y sugerencias para facilitar la introducción del personal interesado. Otra desventaja es que la denudación se hace en la pared arterial normal, y por lo tanto, la formación neo-íntima será moderada en comparación con la situación clínica. El alto nivel de colesterol plasmático alcanzado en ratones apolipoproteína E knockout (Apoe-/-) alimentados con una dieta alta en grasas crea un ambiente proinflamatorio adecuado necesario para la formación neointima.
La cirugía se realiza bajo un estereomicroscopio. La arteria carótida se expone mediante una incisión mediana en el área cervical ventral. Las estructuras anatómicas en la parte superior y alrededor de la arteria carótida se manipulan mínimamente para reducir la inflamación postquirúrgica. La bifurcación de la arteria carótida está expuesta. Para inducir la formación acelerada de neointima, las arterias carótidas internas y externas se preparan para el cese del flujo sanguíneo y la posterior denudación común de la arteria carótida. En conclusión, el método puede ser aprendido por personal con experiencia mínima en cirugías de animales.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, proporcionamos consejos útiles para realizar el procedimiento de lesión por cable incluso por personal con experiencia mínima en cirugías de animales. Hay dos pasos críticos en la realización de este procedimiento: la incisión de la arteria carótida externa y la inserción del alambre. La incisión en la arteria carótida externa debe realizarse en la medida de lo posible desde la bifurcación, con el fin de asegurar suficiente material restante (Figura 1C). La incisión no debe ser demasiado grande, debido al riesgo de cortar todo el vaso. El segundo paso crítico es el alto riesgo de sangrado durante la arteriotomía y la inserción del cable guía si el flujo sanguíneo no se interrumpe eficientemente. Además, es posible que no se realice una denudación endotelial o que la rotura arterial sea posible si el cable guía no se introduce correctamente en el recipiente lumen. Para evitar esto, la superficie del alambre guía debe ser cuidadosamente pulida antes de la operación.
Para optimizar el protocolo, la posición de la mesa de operaciones con la cabeza del ratón hacia el cirujano garantiza una mejor vista, accesibilidad y control para la manipulación adecuada del cable guía. Además, para aumentar la reproducibilidad, utilice el mismo cable guía en todos los estudios. Dado que el tamaño del cable no cambia, es importante considerar y eliminar todas las diferencias posibles entre los ratones mediante el uso del mismo sexo, edad y peso para todos los ratones incluidos en un estudio. A partir de entonces, la tinción Evans-Blue ayudará al cirujano a determinar la eficiencia de la denudación. La existencia de un equipo adecuado es un requisito previo para el éxito del procedimiento. Un estereomicroscopio 10X es esencial para realizar este procedimiento. La preparación adecuada del cable guía (por ejemplo, pulirlo) es crucial. Por lo tanto, recomendamos encarecidamente que la preparación del cable guía sea realizada por personal técnico especializado cuando esté disponible.
Hay muchos pasos de Troubleshooting en este protocolo. Si incigó la arteria carótida externa cerca de la bifurcación, ate cuidadosamente el externo, cerca de la bifurcación, por lo que no se produce sangrado. Durante el corte, no se puede ver la arteria carótida externa. Por lo tanto, considere la bifurcación a nivel de sutura de seda. Recoger secciones cuando la sutura de seda desaparece. Si la incisión en la arteria carótida externa es demasiado grande y el vaso se rompe, asegúrese de que el flujo sanguíneo hacia el communis carótido y la arteria carótida interna se interrumpa eficazmente y trate de encontrar la abertura del vaso utilizando fórceps. Después de introducir el alambre guía y realizar la denudación, atar el recipiente cerca de la bifurcación. Durante el corte, comience a recoger cuando la seda de la sutura comienza a desaparecer. Si se produce una ruptura arterial durante la denudación con el cable guía, compruebe bajo el microscopio si el cable guía está correctamente pulido.
A pesar de la similitud del modelo de lesión por alambre con las situaciones clínicas, muchos grupos se centran en la aterosclerosis nativa en ratones, o eligen inducciones invasivas de aterosclerosis, como la angioplastia con balón en ratas o conejos, debido a la falta de personal capacitado que pueda realizar pequeñas cirugías animales. A pesar de los beneficios del uso de conejos/ratas, por ejemplo, no hay necesidad de equipos miniaturizados, ni los modelos de ratas ni los modelos de conejo ofrecen una variedad de diferentes cepas knock-out, en términos de estudio de los mecanismos moleculares involucrados en el crecimiento neointima y la trombosis en stent.
Los modelos existentes para estudiar la restenosis in-stent en ratones son difíciles, requieren altas habilidades quirúrgicas y tienen altos riesgos de complicaciones como sangrado o parálisis. Por ejemplo, la lesión mecánica o la implantación de stent en la aorta torácica a través de la arteria femoral se acompaña de una alta tasa de mortalidad (35%) debido a la parálisis de las patas traseras o al sangradode 13-15. También describimos la implantación de stent en la arteria carótida de unratón 16. El procedimiento es similar; sin embargo, el procesamiento de tejidos para el análisis es complicado y no está disponible para todos los laboratorios16. La arteria carótida es directamente accesible, no sólo para los procedimientos de operación, sino también para los métodos de diagnóstico por imágenes existentes, como las imágenes por ultrasonido. Otras inducciones por lesiones en las arterias carótidas en ratones se pueden hacer utilizando dispositivos eléctricos17. Este método es fácil de realizar y garantiza una alta reproducibilidad. Sin embargo, induce lesiones en todas las capas de los vasos, que no es idéntica a la lesión mecánica. Las aplicaciones de globos tienen beneficios, por ejemplo, el ajuste al diámetro del recipiente de acuerdo con la práctica clínica y tiene una fuerte influencia en el resultado patológico. A pesar de que los globos de ratón están disponibles, son muy caros y por lo tanto, no son ampliamente utilizados. En su lugar, la lesión por alambre es el método establecido, imitando la estenosis in-stent.
La denudación se realiza en la pared arterial normal, aunque con un fondo aterosclerótico. Por lo tanto, la formación de neointima será moderada en comparación con la situación clínica. El elevado número de modelos preclínicos demuestra que ninguno de los modelos cumple todos los criterios necesarios para descubrir la totalidad de los mecanismos celulares y moleculares que conducen a la fisiopatología en humanos (véase el cuadro 2).
Después de realizar el procedimiento de lesión por cable, se pueden realizar otros análisis biológicos y moleculares para identificar células, proteínas, mRNAs, microARNas, genes u otros biomarcadores, que pueden utilizarse como dianas terapéuticas para desarrollar nuevas estrategias de tratamiento para la aterosclerosis, y en particular para la formación de neointimación después de la lesión vascular. Si está disponible, el crecimiento de la placa se puede monitorear mediante ultrasonido de alta frecuencia u otras técnicas de imágenes de alta resolución. Además, dominar esta técnica daría al operador la oportunidad de adaptar el protocolo a otros modelos invasivos de incentivo a la aterosclerosis, como la colocación del collar, la ligadura parcial o incluso la implantación de stent.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica IZKF Aachen (grupo de investigación junior a E.A.L.) dentro de la facultad de Medicina de la Universidad RWTH Aachen. También agradecemos a la Sra. Roya Soltan por su ayuda con la tinción de inmunohistoquímica.
Materials
| Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | – |
| Forceps | FST, Germany | 91197-00 | standard tip curved 0,17 mm |
| Hemostat forceps | FST, Germany | 13007-12 | curved |
| Scissors | FST, Germany | 91460-11 | Straight |
| Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | – |
| Retractors | FST, Germany | 18200-10 | 2.5mm wide |
| Retractors | FST, Germany | 18200-11 | 5mm wide |
| Ketamine 10% | CEVA, Germany | – | – |
| Xylazine 2% | Medistar, Germany | – | – |
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | – | – |
| Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custom-made product | diameter 500µm, |
| section thickness 100 µm, | |||
| polytetrafluorethylene catheter | |||
| PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle |
| 7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | – |
| Michel Suture Clips | FST, Germany | 12040-01 | - |
| Clip Applying Forcep | FST, Germany | 12018-12 | - |
| 14”Wire for Catheter | Abbot | 1000462H | Use 10 cm from stiff part and equalize the ends |
| Mice | Charles River | Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background | - |
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