מחקר זה מתאר הליך פולשני עבור אינדוקציה של טרשת עורקים מואצת בעכברים. בהשוואה לשיטות אחרות באמצעות פגיעה חשמלית או הקפאה, פציעה כתוצאה מכני מחקה את המצב האנושי של restenosis לאחר טיפולים revascularization והוא אידיאלי לחקר המנגנונים המולקולריים המעורבים.
טרשת עורקים היא מחלה פיברו דלקתית מתפשטת המתפתחת בקיר העורקי, גורם זרימת דם לקויה או חוסר זרימת דם. יתר על כן, על ידי קרע של קיר כלי הדם פגום, טרשת עורקים גורמת היווצרות טרומבוס occlusive, אשר מייצג את הגורם העיקרי של אוטם שריר הלב או שבץ ואת סיבת המוות השכיחה ביותר. למרות ההתקדמות בתחום הלב וכלי הדם, שאלות רבות נותרו ללא מענה, ומחקר בסיסי נוסף חיוני כדי לשפר את הבנתנו את המנגנונים המולקולריים במהלך טרשת עורקים והשפעותיה. בשל מחקרים קליניים מוגבלים, יש צורך במודלים מייצגים של בעלי חיים המשפרים תנאי טרשת עורקים כגון היווצרות neointima לאחר השתלת סטנט, אנגיופלסטיקה בלון, או כריתת קצה. מאז העכבר מציג יתרונות רבים והוא המודל הנפוץ ביותר לחקר תהליכים מולקולריים, המחקר הנוכחי מציע הליך פולשני של השחתה אנדותל, המכונה גם מודל פגיעת חוט, אשר מייצג את המצב האנושי של היווצרות neointima בעורקים לאחר הליכי revascularization.
טרשת עורקים היא הפתולוגיה העיקרית הבסיסית אירועים לב וכלי דם כגון אוטם שריר הלב או שבץ מוחי. המנגנונים העיקריים המפעילים תסמונות לב וכלי דם חריפים הם קרע פלאק, שחיקה שטחית, היווצרות טרומבוס. ישנם מצבים קליניים מרובים הקשורים להתפתחות הפלאק: פלאק טרשת עורקים מקורית, restenosis לאחר כריתת קצה, ו restenosis לאחר אנגיופלסטיקה בלון עם / בלי השתלת סטנט1. לאחר פגיעה עורקית,דיכוי של תהליכים דלקתיים 2,3 ואת ההתאוששות של תא אנדותל חיוניים כדי למנוע סיבוכים נוספים1. מחקר קליני מוגבל לדגימות רקמות ודם בשל שיקולים אתיים, עלויות, וחוסר ידע במנגנונים בסיסיים. מסיבות אלה, יש צורך ללמוד מנגנונים מולקולריים במודלים של בעליחיים 4-6, אשר יכול לשחזר את התנאים הקליניים. המודל שלנו של היווצרות neointima מואצת בהקשר של טרשת עורקים הוא תוצאה של שנים רבות של ניסיון ביישום מודלים אלה בבעלי חיים קטנים7-11. מודל העכבר הוא המודל האטרקטיבי ביותר למחקר, בשל קלות הטיפול בו, היכולת לקבוצות בעלי חיים גדולות בשל עלויות נמוכות הקשורות לרכישה וטיפול בבעלי חיים, והזמינות של זנים טרנסגניים ונוקאאוט שונים.
החיסרון העיקרי של מודל העכבר הוא הגודל הקטן של העורקים הראשיים הנתונים למחלות עורקים (העורק הראשי, אב העורקים, ועורק הירך), אשר דורש מומחיות כירורגית מוסמכת ומיומנויות כדי לתמרן את כלי הדם ולגרום באופן פולשני פלאק טרשת עורקים. לכן, המודל של היווצרות neointima מואצת, בהקשר של restenosis לאחר endarterectomy או השתלת סטנט, המוצעים בנייר זה מוצג עם קו מנחה צעד אחר צעד והצעות כדי להקל על המבוא עבור אנשי עניין. חיסרון נוסף הוא כי ההתעטשות נעשתה על הקיר העורקי הרגיל, ולכן, היווצרות ניאו-אינטימה יהיה מתון בהשוואה למצב הקליני. הרמה הגבוהה של כולסטרול פלזמה הגיע נוקאאוט apolipoprotein E(Apoe-/-) עכברים המוזנים עם דיאטת שומן גבוהה יוצרת סביבה פרו דלקתית נכונה הדרושה להיווצרות ניאו-אינטימה.
הניתוח מתבצע תחת סטריאומיקרוסקופ. העורק הראשי נחשף על ידי חתך חציון באזור צוואר הרחם הפתחי. מבנים אנטומיים על גבי וסביב העורק הראשי הם מניפולציה מינימלית כדי להפחית דלקת לאחר הניתוח. הדו-ריתום בעורק הראשי נחשף. כדי לגרום להיווצרות neointima מואצת, עורקים ראשיים פנימיים וחיצוניים מוכנים להפסקת זרימת הדם וההפשה נפוצה בעורק הראשי לאחר מכן. לסיכום, ניתן ללמוד את השיטה על ידי אנשים בעלי ניסיון מינימלי בניתוחים בבעלי חיים.
בנייר זה, אנו מספקים טיפים שימושיים לביצוע הליך פגיעה בחוט גם על ידי אנשים עם ניסיון מינימלי בניתוחים בבעלי חיים. ישנם שני שלבים קריטיים בביצוע הליך זה: החתך של העורק הראשי החיצוני והחדרת החוט. החתך בעורק הראשי החיצוני צריך להתבצע ככל האפשר מן bifurcation, על מנת להבטיח מספיק חומר שנותר(איור 1C). החתך לא צריך להיות גדול מדי, בשל הסיכון של חיתוך הכלי כולו. השלב הקריטי השני הוא הסיכון הגבוה לדימום במהלך כריתת העורקים והחדרת חוט התיל אם זרימת הדם אינה הופסקה ביעילות. יתר על כן, ההתבוללות האאנדותל לא יכול להתרחש או קרע עורקי אפשרי אם חוט המדריך אינו הציג כראוי בכלי לומן. כדי להימנע מכך, יש ללטש בזהירות את פני השטח של חוט היישור לפני הפעולה.
כדי לייעל את הפרוטוקול, המיקום של טבלת ההפעלה עם ראש העכבר לכיוון המנתח מבטיח תצוגה טובה יותר, נגישות ובקרה עבור מניפולציה נכונה חוט מדריך. יתר על כן, כדי להגדיל את הרבייה, להשתמש באותו חוט מדריך בכל המחקרים. מאחר שגודל החוט אינו משתנה, חשוב לשקול ולחסל את כל ההבדלים האפשריים בין העכברים באמצעות אותו מין, גיל ומשקל עבור כל העכברים הכלולים במחקר. לאחר מכן, הכתמה אוונס-כחול יעזור למנתח לקבוע את היעילות של ההתעבה. קיומו של ציוד מתאים הוא תנאי מוקדם להצלחת ההליך. סטריאומיקרוסקופ 10X חיוני לביצוע הליך זה. ההכנה הנכונה של חוט היישור (למשל ליטושו) היא קריטית. לכן, אנו ממליצים בחום כי הכנת חוט מדריך להתבצע על ידי צוות טכני מיוחד איפה זמין.
קיימים שלבים רבים לפתרון בעיות בפרוטוקול זה. אם חותך את העורק הראשי החיצוני ליד bifurcation, בזהירות לקשור את externa, ליד bifurcation, כך לא מתרחש דימום. במהלך החיתוך, העורק הראשי החיצוני לא ניתן לראות. לכן, לשקול את bifurcation ברמה של תפר משי. לאסוף קטעים כאשר תפר משי נעלם. אם החתך בעורק הראשי החיצוני גדול מדי וכלי הדם נקרע, ודא שזרימת הדם לתוך הקומוניס בעורק הראשי והעורק הראשי הפנימי נקטעת ביעילות ומנסה למצוא את פתח כלי הדם באמצעות מפסים. לאחר הצגת חוט הנחייה וביצוע ההתבוללות, קשרו את כלי השיט ליד ההתפוררות. במהלך החיתוך, להתחיל לאסוף כאשר המשי מהתפר מתחיל להיעלם. אם הקרע העורקי מתרחש במהלך ההתעטשות עם חוט הנחיה, בדוק מתחת למיקרוסקופ אם חוט הנחיה מלוטש כראוי.
למרות הדמיון של מודל פגיעת תיל למצבים קליניים, קבוצות רבות מתמקדות טרשת עורקים מקומית בעכברים, או שהם בוחרים אינדוקציה טרשת עורקים פולשנית, כגון אנגיופלסטיקה בלון בחולדות או ארנבים, בשל חוסר כוח אדם מיומן שיכול לבצע ניתוחים בעלי חיים קטנים. למרות היתרונות של שימוש ארנבים / חולדות, למשל אין צורך בציוד ממזער, לא מודלים חולדה ולא מודלים ארנב להציע מגוון רחב של זנים נוק אאוט שונים, במונחים של לימוד מנגנונים מולקולריים מעורבים צמיחה neointima ופקקת ב סטנט.
המודלים הקיימים ללימוד רסנטים בעכברים הם קשים, דורשים כישורים כירורגיים גבוהים, ויש להם סיכונים גבוהים של סיבוכים כגון דימום או שיתוק. לדוגמה, הפציעה המכנית או השתלת סטנט לתוך בית החזה באמצעות עורק הירך מלווה בשיעור תמותה גבוה (35%) עקב שיתוק ברגל האחורית או דימום13-15. אנו גם מתארים השתלת סטנט בעורק הראשי של עכבר16. ההליך דומה; עם זאת, עיבוד רקמות לניתוח הוא מסובך והוא אינו זמין לכל המעבדות16. העורק הראשי נגיש ישירות, לא רק עבור הליכי פעולה, אלא גם עבור שיטות הדמיה קיימות כגון הדמיית אולטרסאונד. אינדוקציה פציעה אחרים בעורקים הראשיים בעכברים יכול להיעשות באמצעות מכשירים חשמליים17. שיטה זו קלה לביצוע ומבטיחה שכפול גבוה. עם זאת, היא גורם לפציעה בכל שכבות כלי הדם, שאינה זהה לפציעה מכנית. יישומי בלון יש יתרונות, למשל ההתאמה לקוטר כלי העבודה בקנה אחד עם הפרקטיקה הקלינית ויש לו השפעה חזקה על התוצאה הפתולוגית. למרות בלוני עכבר זמינים, הם יקרים מאוד ולכן, לא בשימוש נרחב. במקום זאת, פגיעת התיל היא השיטה המבוססת, המחקה היצרות בסטינט.
ההסתה מתבצעת על הקיר העורקי הרגיל, אם כי עם רקע טרשת עורקים. לכן, היווצרות neointima יהיה מתון בהשוואה למצב הקליני. המספר הגבוה של מודלים פרה-לקלינליים מדגים כי אף אחד מהמודלים לא ממלא את כל הקריטריונים הדרושים כדי לחשוף את שלמות המנגנונים הסלולריים והמולקולריים המובילים לפתופיזיולוגיה בבני אדם (ראה טבלה 2).
לאחר ביצוע הליך פגיעה בחוט, ניתן לבצע ניתוח ביולוגי ומולקולרי אחר כדי לזהות תאים, חלבונים, mRNAs, microRNAs, גנים או סמנים ביולוגיים אחרים, אשר יכול לשמש כיעדים טיפוליים לפתח אסטרטגיות טיפול חדשות לטישת עורקים, ובמיוחד עבור היווצרות neointima לאחר פגיעה בכלי הדם. אם זמין, צמיחת הפלאק ניתן לפקח באמצעות אולטרסאונד בתדר גבוה או טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה אחרות. יתר על כן, שליטה בטכניקה זו תעניק למפעיל את ההזדמנות להתאים את הפרוטוקול למודלים אחרים של טרשת עורקים פולשנית, כגון מיקום הבריחון, קשירה חלקית או אפילו השתלת סטנט.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הבינתחומי למחקר קליני IZKF Aachen (קבוצת מחקר זוטרה E.A.L.) בתוך הפקולטה לרפואה באוניברסיטת RWTH אאכן. אנו גם מודים לגברת רויה סולטן על העזרה בהכתמת אימונוהיסטוכימיה.
Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | – |
Forceps | FST, Germany | 91197-00 | standard tip curved 0,17 mm |
Hemostat forceps | FST, Germany | 13007-12 | curved |
Scissors | FST, Germany | 91460-11 | Straight |
Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | – |
Retractors | FST, Germany | 18200-10 | 2.5mm wide |
Retractors | FST, Germany | 18200-11 | 5mm wide |
Ketamine 10% | CEVA, Germany | – | – |
Xylazine 2% | Medistar, Germany | – | – |
Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | – | – |
Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custom-made product | diameter 500µm, |
section thickness 100 µm, | |||
polytetrafluorethylene catheter | |||
PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle |
7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | – |
Michel Suture Clips | FST, Germany | 12040-01 | - |
Clip Applying Forcep | FST, Germany | 12018-12 | - |
14”Wire for Catheter | Abbot | 1000462H | Use 10 cm from stiff part and equalize the ends |
Mice | Charles River | Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background | - |