Induktion von beschleunigter Atherosklerose bei Mäusen: Das "Wire-Injury"-Modell
Summary
Diese Studie beschreibt ein invasives Verfahren zur Induktion von beschleunigter Arteriosklerose bei Mäusen. Im Vergleich zu anderen Methoden, bei der elektrisch oder kryoinduzierte Verletzungen verwendet werden, imitiert die mechanisch induzierte Verletzung den menschlichen Zustand der Restenose nach Revaskularisationstherapien und ist ideal für die Untersuchung der beteiligten molekularen Mechanismen.
Abstract
Atherosklerose ist eine proliferative fibro-entzündliche Erkrankung, die sich in der arteriellen Wand entwickelt und einen mangelhaften Blutfluss oder einen Mangel an Blutfluss induzieren. Darüber hinaus induziert Die Arteriosklerose durch Bruch der defekten Gefäßwand eine okklusive Thrombusbildung, die die Hauptursache für Myokardinfarkt oder Schlaganfall und die häufigste Todesursache darstellt. Trotz der Fortschritte im kardiovaskulären Bereich bleiben viele Fragen unbeantwortet, und zusätzliche Grundlagenforschung ist unerlässlich, um unser Verständnis der molekularen Mechanismen bei Arteriosklerose und ihrer Auswirkungen zu verbessern. Aufgrund begrenzter klinischer Studien besteht bedarf es repräsentativer Tiermodelle, die atherosklerotische Erkrankungen wie neointimaische Bildung nach Stentimplantation, Ballonangioplastie oder Endarterektomie nachbilden. Da die Maus viele Vorteile bietet und das am häufigsten verwendete Modell für die Untersuchung molekularer Prozesse ist, schlägt die aktuelle Studie ein invasives Verfahren der endotheliaalen Denudation vor, auch bekannt als draht-Verletzungsmodell, das für den menschlichen Zustand der Neointimabildung in Arterien nach Revaskularisationsverfahren repräsentativ ist.
Introduction
Atherosklerose ist die wichtigste Pathologie, die kardiovaskulären Ereignissen wie Myokardinfarkt oder Schlaganfall zugrunde liegt. Die Hauptmechanismen, die akute kardiovaskuläre Syndrome auslösen, sind Plaquebruch, oberflächliche Erosion und Thrombusbildung. Es gibt mehrere klinische Situationen, die mit der Plaqueentwicklung verbunden sind: native atherosklerotische Plaque, Restenose nach Endarterektomie und Restenose nach Ballonangioplastie mit/ohne Stentimplantation1. Nach arteriellen Verletzungen sind die Unterdrückung der entzündlichen Prozesse2,3 und die Rückgewinnung des Endothelfachs unerlässlich, um weitere Komplikationen zu verhindern1. Klinische Forschung beschränkt sich auf Gewebe- und Blutproben aufgrund ethischer Erwägungen, Kosten und mangelnder Kenntnisse in grundlegenden Mechanismen. Aus diesen Gründen ist es notwendig, molekulare Mechanismen in Tiermodellen4-6zu untersuchen, die die klinischen Bedingungen nachbilden können. Unser Modell der beschleunigten Neointimabildung im Zusammenhang mit Arteriosklerose ist das Ergebnis langjähriger Erfahrung in der Umsetzung dieser Modelle bei Kleintieren7-7 . Das Mausmodell ist das attraktivste Modell für die Forschung, aufgrund seiner einfachen Handhabung, der Fähigkeit, große Tiergruppen aufgrund der niedrigen Kosten im Zusammenhang mit dem Kauf und der Pflege von Tieren zu haben, und der Verfügbarkeit verschiedener transgener und Knockout-Stämme.
Der Hauptnachteil des Mausmodells ist die geringe Größe der Hauptarterien, die einer atherosklerotischen Erkrankung ausgesetzt sind (die Halsschlagader, die Aorta und die Oberschenkelarterie), die qualifizierte chirurgische Kenntnisse und Fähigkeiten erfordert, um die Gefäße zu manipulieren und eine atherosklerotische Plaque invasiv zu induzieren. Daher wird das in diesem Papier vorgeschlagene Modell der beschleunigten Neointimabildung im Kontext der Restenose nach Endarterektomie oder Stentimplantation mit einer Schritt-für-Schritt-Richtlinie und Vorschlägen zur Erleichterung der Einführung für interessiertes Personal vorgestellt. Ein weiterer Nachteil ist, dass die Denudation an der normalen arteriellen Wand erfolgt, und daher wird die Neo-Intima-Bildung im Vergleich zur klinischen Situation moderat sein. Der hohe Gehalt an Plasmacholesterin, das in Apolipoprotein E Knockout (Apoe-/-) Mäuse erreicht wird, die mit einer hohen Fettdiät gefüttert werden, schafft eine richtige pro-inflammatorische Umgebung, die für die Neo-Intima-Bildung benötigt wird.
Die Operation wird unter einem Stereomikroskop durchgeführt. Die Halsschlagader wird durch einen medianen Schnitt im ventralen Zervixbereich ausgesetzt. Anatomische Strukturen auf und um die Halsschlagader werden minimal manipuliert, um postoperative Entzündungen zu reduzieren. Die Carotis-Arterien-Bifurkation wird ausgesetzt. Um eine beschleunigte Neointimabildung zu induzieren, werden innere und äußere Karotisarterien für die Abhörung des Durchflusses und die anschließende häufige Karotisarterienverweigerung vorbereitet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Methode von Mitarbeitern mit minimaler Erfahrung in Tieroperationen erlernt werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Beitrag geben wir nützliche Tipps, um den Draht-Verletzungs-Verfahren auch von Mitarbeitern mit minimaler Erfahrung in Tieroperationen durchzuführen. Es gibt zwei kritische Schritte bei der Durchführung dieses Verfahrens: den Einschnitt der äußeren Halsschlagader und das Einsetzen des Drahtes. Der Schnitt in der äußeren Halsschlagader muss so weit wie möglich aus der Bifurkation durchgeführt werden, um genügend Restmaterial zu gewährleisten (Abbildung 1C). Der Schnitt sollte nicht zu groß sein, da das Risiko besteht, das gesamte Gefäß zu schneiden. Der zweite kritische Schritt ist das hohe Blutungsrisiko während der Arteriotomie und das Einsetzen des Führungsdrahtes, wenn der Blutfluss nicht effizient eingestellt wird. Darüber hinaus kann es nicht zu einer Endotheldenudation kommen oder ein arterieller Bruch ist möglich, wenn der Führungsdraht nicht ordnungsgemäß in das Lumengefäß eingeführt wird. Um dies zu vermeiden, muss die Oberfläche des Führungsdrahtes vor dem Betrieb sorgfältig poliert werden.
Um das Protokoll zu optimieren, sorgt die Position des Operationstisches mit dem Mauskopf in Richtung des Chirurgen für eine bessere Sicht, Zugänglichkeit und Kontrolle für die richtige Führungsdrahtmanipulation. Darüber hinaus, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen, verwenden Sie den gleichen Führungsdraht in allen Studien. Da sich die Drahtgröße nicht ändert, ist es wichtig, alle möglichen Unterschiede zwischen den Mäusen zu berücksichtigen und zu beseitigen, indem für alle Mäuse, die in einer Studie enthalten sind, das gleiche Geschlecht, alter und das gleiche Gewicht verwendet wird. Danach wird Evans-Blue Färbung dem Chirurgen helfen, die Effizienz der Denudation zu bestimmen. Das Vorhandensein geeigneter Ausrüstungen ist eine Voraussetzung für den Erfolg des Verfahrens. Ein 10-Fach-Stereomikroskop ist für die Durchführung dieses Verfahrens unerlässlich. Die richtige Vorbereitung des Führungsdrahtes (z.B. Polieren) ist entscheidend. Daher empfehlen wir dringend, die Drahtvorbereitung durch spezialisiertes technisches Personal durchzuführen, sofern verfügbar.
Dieses Protokoll hat viele Schritte zur Fehlerbehebung. Wenn Sie die äußere Halsschlagader in der Nähe der Bifurkation einschneiden, binden Sie die Externa vorsichtig in der Nähe der Bifurkation, so dass keine Blutungen auftreten. Beim Schneiden ist die äußere Halsschlagader nicht zu sehen. Betrachten Sie daher die Bifurkation auf der Ebene der Seidennaht. Sammeln Sie Abschnitte, wenn die Seidennaht verschwindet. Wenn der Einschnitt in die äußere Halsschlagader zu groß ist und das Gefäß gebrochen wird, stellen Sie sicher, dass der Blutfluss in die Karotis-Communis und die innere Halsschlagader effektiv unterbrochen wird und versuchen, die Öffnung des Gefäßes mit Zangen zu finden. Nach dem Einführen des Führungsdrahtes und der Denudation, binden Sie das Gefäß in der Nähe der Bifurkation. Während des Schneidens, beginnen zu sammeln, wenn die Seide aus der Naht beginnt zu verschwinden. Wenn während der Denudation mit dem Führungsdraht ein arterieller Bruch auftritt, überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob der Führungsdraht richtig poliert ist.
Trotz der Ähnlichkeit des Drahtverletzungsmodells mit klinischen Situationen konzentrieren sich viele Gruppen auf einheimische Arteriosklerose bei Mäusen, oder sie wählen invasive Arteriosklerose-Induktionen, wie Ballon-Angioplastie bei Ratten oder Kaninchen, wegen des Mangels an ausgebildetem Personal, das kleine Tieroperationen durchführen kann. Trotz der Vorteile der Verwendung von Kaninchen/Ratten, z. B. ohne miniaturisierte Ausrüstung, bieten weder Rattenmodelle noch Kaninchenmodelle eine Vielzahl unterschiedlicher Knock-out-Stämme an, was die Untersuchung molekularer Mechanismen betrifft, die an Neointimawachstum und In-Stent-Thrombose beteiligt sind.
Die bestehenden Modelle für das Studium der In-Stent-Restenose bei Mäusen sind schwierig, erfordern hohe chirurgische Fähigkeiten und haben ein hohes Risiko von Komplikationen wie Blutungen oder Lähmungen. Zum Beispiel wird die mechanische Verletzung oder Stent-Implantation in die Thoraxaorta über die Oberschenkelarterie von einer hohen Sterblichkeitsrate begleitet (35%) aufgrund von Unterschenkellähmung oder Blutungen13-15. Wir beschreiben auch Stent-Implantation in der Halsschlagader einer Maus16. Das Verfahren ist ähnlich; die Gewebeverarbeitung für die Analyse ist jedoch kompliziert und steht nicht allen Laboratorien zur Verfügung16. Die Halsschlagader ist direkt zugänglich, nicht nur für Operationsverfahren, sondern auch für bestehende bildgebende Verfahren wie Ultraschall-Bildgebung. Andere Verletzungsinduktionen in den Karotisarterien bei Mäusen können mit elektrischen Geräten durchgeführt werden17. Diese Methode ist einfach durchzuführen und sorgt für eine hohe Reproduzierbarkeit. Es führt jedoch zu Verletzungen in allen Gefäßschichten, die nicht mit mechanischen Verletzungen identisch sind. Ballonanwendungen haben Vorteile, z.B. die Anpassung an den Gefäßdurchmesser im Einklang mit der klinischen Praxis und haben einen starken Einfluss auf das pathologische Ergebnis. Obwohl Mausballons verfügbar sind, sind sie sehr teuer und daher nicht weit verbreitet. Stattdessen ist die Drahtverletzung die etablierte Methode, die In-Stent-Stenose imitiert.
Die Denudation wird an der normalen arteriellen Wand durchgeführt, wenn auch mit einem atherosklerotischen Hintergrund. Daher wird die Neointima-Bildung im Vergleich zur klinischen Situation moderat sein. Die hohe Anzahl präklinischer Modelle zeigt, dass keines der Modelle alle Kriterien erfüllt, die notwendig sind, um die Gesamtheit der zellulären und molekularen Mechanismen aufzudecken, die zur Pathophysiologie beim Menschen führen (siehe Tabelle 2).
Nach der Durchführung des Drahtverletzungsverfahrens können andere biologische und molekulare Analysen durchgeführt werden, um Zellen, Proteine, mRNAs, microRNAs, Gene oder andere Biomarker zu identifizieren, die als therapeutische Ziele zur Entwicklung neuer Behandlungsstrategien für Arteriosklerose und insbesondere für die Neointimabildung nach Gefäßverletzungen verwendet werden können. Sofern verfügbar, kann das Plaquewachstum mit hochfrequentem Ultraschall oder anderen hochauflösenden Bildgebungstechniken überwacht werden. Darüber hinaus würde die Beherrschung dieser Technik dem Bediener die Möglichkeit geben, das Protokoll an andere invasive Arteriosklerose-Induktionsmodelle anzupassen, wie z. B. Kragenplatzierung, Partielle Ligation oder sogar Stent-Implantation.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung IZKF Aachen (Junior Research Group to E.A.L.) innerhalb der Fakultät für Medizin der RWTH Aachen unterstützt. Wir danken auch Frau Roya Soltan für die Hilfe bei der Immunhistochemie Färbung.
Materials
| Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | – |
| Forceps | FST, Germany | 91197-00 | standard tip curved 0,17 mm |
| Hemostat forceps | FST, Germany | 13007-12 | curved |
| Scissors | FST, Germany | 91460-11 | Straight |
| Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | – |
| Retractors | FST, Germany | 18200-10 | 2.5mm wide |
| Retractors | FST, Germany | 18200-11 | 5mm wide |
| Ketamine 10% | CEVA, Germany | – | – |
| Xylazine 2% | Medistar, Germany | – | – |
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | – | – |
| Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custom-made product | diameter 500µm, |
| section thickness 100 µm, | |||
| polytetrafluorethylene catheter | |||
| PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle |
| 7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | – |
| Michel Suture Clips | FST, Germany | 12040-01 | - |
| Clip Applying Forcep | FST, Germany | 12018-12 | - |
| 14”Wire for Catheter | Abbot | 1000462H | Use 10 cm from stiff part and equalize the ends |
| Mice | Charles River | Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background | - |
References
- Simsekyilmaz, S., Liehn, E. A., Militaru, C., Vogt, F. Progress in interventional cardiology: challenges for the future. Thromb Haemost. 113 (3), 464-472 (2015).
- Kubo, N., McCurdy, S., Boisvert, W. A. Defective Fas Expression on Bone Marrow Derived Cells Alters Atherosclerotic Plaque Morphology in Hyperlipidemic Mice. Discoveries. 3 (1), e37 (2015).
- Saffarzadeh, M., et al. Characterization of rapid neutrophil extracellular trap formation and its cooperation with phagocytosis in human neutrophils. Discoveries. 2 (2), e19 (2014).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. Mouse model of arterial injury. Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).
- Schwartz, R. S., et al. Preclinical evaluation of drug-eluting stents for peripheral applications: recommendations from an expert consensus group. Circulation. 110 (16), 2498-2505 (2004).
- Schwartz, R. S., et al. Restenosis and the proportional neointimal response to coronary artery injury: results in a porcine model. J Am Coll Cardiol. 19 (2), 267-274 (1992).
- Curaj, A., et al. Noninvasive molecular ultrasound monitoring of vessel healing after intravascular surgical procedures in a preclinical setup. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1366-1373 (2015).
- Liehn, E. A., Schober, A., Weber, C. Blockade of keratinocyte-derived chemokine inhibits endothelial recovery and enhances plaque formation after arterial injury in ApoE-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (10), 1891-1896 (2004).
- Liehn, E. A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C. Chemokines: inflammatory mediators of atherosclerosis. Arch Physiol Biochem. 112 (4-5), 229-238 (2006).
- Simsekyilmaz, S., et al. Role of extracellular RNA in atherosclerotic plaque formation in mice. Circulation. 129 (5), 598-606 (2014).
- Wu, Z., et al. Rhodamine-loaded intercellular adhesion molecule-1-targeted microbubbles for dual-modality imaging under controlled shear stresses. Circ Cardiovasc Imaging. 6 (6), 974-981 (2013).
- Schober, A., et al. Crucial role of the CCL2/CCR2 axis in neointimal hyperplasia after arterial injury in hyperlipidemic mice involves early monocyte recruitment and CCL2 presentation on platelets. Circ Res. 95 (11), 1125-1133 (2004).
- Ali, Z. A., et al. Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 833-840 (2007).
- Chamberlain, J., et al. A novel mouse model of in situ stenting. Cardiovasc Res. 85, 38-44 (2010).
- Rodriguez-Menocal, L., et al. A novel mouse model of in-stent restenosis. Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).
- Simsekyilmaz, S., et al. A murine model of stent implantation in the carotid artery for the study of restenosis. J Vis Exp. , e50233 (2013).
- Schroder, K., et al. NADPH oxidase Nox2 is required for hypoxia-induced mobilization of endothelial progenitor cells. Circ Res. 105 (6), 537-544 (2009).
