Inductie van versnelde atherosclerose bij muizen: het "Wire-Injury" Model
Summary
Deze studie beschrijft een invasieve procedure voor de inductie van versnelde atherosclerose bij muizen. In vergelijking met andere methoden met behulp van elektrisch- of cryo-geïnduceerde letsel, mechanisch geïnduceerde letsel bootst de menselijke conditie van restenose na revascularisatie therapieën en is ideaal voor de studie van de betrokken moleculaire mechanismen.
Abstract
Atherosclerose is een prolifererende fibro-ontstekingsziekte die zich ontwikkelt in de slagaderlijke wand, waardoor een deficiënte bloedstroom of een gebrek aan bloedstroom ontstaat. Bovendien, door breuk van de defecte vaatwand, atherosclerose induceert occlusieve trombus vorming, die de belangrijkste oorzaak van hartinfarct of beroerte en de meest voorkomende doodsoorzaak vertegenwoordigt. Ondanks de vooruitgang op cardiovasculair gebied, blijven veel vragen onbeantwoord, en aanvullend fundamenteel onderzoek is essentieel om ons begrip van de moleculaire mechanismen tijdens atherosclerose en de effecten ervan te verbeteren. Als gevolg van beperkte klinische studies is er behoefte aan representatieve diermodellen die atherosclerotische aandoeningen namaken, zoals neointimavorming na stentimplantatie, ballonogioplastie of endarterectomie. Aangezien de muis vele voordelen biedt en het meest gebruikte model is voor het bestuderen van moleculaire processen, stelt de huidige studie een invasieve procedure voor van endotheel denudatie, ook bekend als het draadletselmodel, dat representatief is voor de menselijke conditie van neointimavorming in slagaders na revascularisatieprocedures.
Introduction
Atherosclerose is de belangrijkste pathologie die ten grondslag ligt aan cardiovasculaire gebeurtenissen zoals een hartinfarct of beroerte. De belangrijkste mechanismen triggering acute cardiovasculaire syndromen zijn plaque breuk, oppervlakkige erosie, en trombus vorming. Er zijn meerdere klinische situaties verbonden met de plaqueontwikkeling: inheemse atherosclerotische plaque, restenose na endarterectomie en restenose na ballonanogioplastie met/zonder stentimplantatie1. Na arteriële schade zijn onderdrukking van de ontstekingsprocessen2,3 en het herstel van het endotheelcompartiment essentieel om verdere complicaties te voorkomen1. Klinisch onderzoek is beperkt tot weefsel- en bloedmonsters vanwege ethische overwegingen, kosten en een gebrek aan kennis in basismechanismen. Om deze redenen is het noodzakelijk om moleculaire mechanismen te bestuderen in diermodellen4-6,die de klinische omstandigheden kunnen herscheppen. Ons model van versnelde neointima vorming in de context van atherosclerose is het resultaat van vele jaren ervaring in de implementatie van deze modellen bij kleine dieren7-11. De muis model is het meest aantrekkelijke model voor onderzoek, vanwege het gemak van de behandeling, de mogelijkheid om grote diergroepen als gevolg van lage kosten in verband met de aankoop en verzorging van dieren, en de beschikbaarheid van verschillende transgene en knock-out stammen.
Het grote nadeel van het muismodel is de kleine omvang van de belangrijkste slagaders die worden blootgesteld aan atherosclerotische ziekte (de halsslagader, de aorta en de dijbeenslagader), die gekwalificeerde chirurgische expertise en vaardigheden vereist om de bloedvaten te manipuleren en een atherosclerotische plaque invasief te induceren. Daarom wordt het model van versnelde neointimavorming, in de context van restenose na endarterectomie of stentimplantatie, voorgesteld in dit document gepresenteerd met een stapsgewijze richtlijn en suggesties om de introductie voor geïnteresseerd personeel te vergemakkelijken. Een ander nadeel is dat de denudatie wordt gemaakt op de normale arteriële wand, en daarom zal de neo-intima-formatie matig zijn in vergelijking met de klinische situatie. Het hoge niveau van plasma cholesterol bereikt in apolipoprotein E knock-out(Apoe-/-) muizen gevoed met een hoog vet-dieet creëert een goede pro-inflammatoire omgeving die nodig is voor de neo-intima vorming.
De operatie wordt uitgevoerd onder een stereomicroscoop. De halsslagader wordt blootgesteld door een mediane incisie in het ventrale cervicale gebied. Anatomische structuren op de top van en rond de halsslagader zijn minimaal gemanipuleerd om postchirurgische ontsteking te verminderen. De halsslagader bifurcatie wordt blootgesteld. Om versnelde neointimavorming te induceren, worden interne en externe halsslagaders voorbereid op de stopzetting van de bloedstroom en de daaropvolgende gemeenschappelijke halsslagaderontwijking. Tot slot kan de methode worden geleerd door personeel met minimale ervaring in dierlijke operaties.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze paper geven we nuttige tips om de draad-letsel procedure uit te voeren, zelfs door personeel met minimale ervaring in dierlijke operaties. Er zijn twee kritieke stappen in het uitvoeren van deze procedure: de incisie van de externe halsslagader en het inbrengen van de draad. De incisie in de externe halsslagader moet zoveel mogelijk vanaf de splitsing worden uitgevoerd om voldoende resterende materialen te garanderen (figuur 1C). De incisie mag niet te groot zijn, vanwege het risico van het snijden van het hele vat. De tweede kritieke stap is het hoge risico op bloeden tijdens de arteriotomie en het inbrengen van de geleidedraad als de bloedstroom niet efficiënt wordt stopgezet. Bovendien kan endotheel denudatie niet plaatsvinden of is een arteriële breuk mogelijk als de geleidedraad niet goed in het lumenvat wordt geïntroduceerd. Om dit te voorkomen, moet het oppervlak van de geleidedraad zorgvuldig worden gepolijst vóór de bewerking.
Om het protocol te optimaliseren, zorgt de positie van de operatietafel met de muiskop richting de chirurg voor een beter zicht, toegankelijkheid en controle voor de juiste geleidedraadmanipulatie. Bovendien, om de reproduceerbaarheid te verhogen, gebruik maken van dezelfde geleide draad in alle studies. Aangezien de draadgrootte niet verandert, is het belangrijk om alle mogelijke verschillen tussen de muizen te overwegen en te elimineren door hetzelfde geslacht, leeftijd en gewicht te gebruiken voor alle muizen die in een studie zijn opgenomen. Daarna zal Evans-Blue vlekken de chirurg helpen bij het bepalen van de efficiëntie van de denudatie. Het bestaan van geschikte apparatuur is een voorwaarde voor het welslagen van de procedure. Een 10X stereomicroscoop is essentieel voor het uitvoeren van deze procedure. De juiste voorbereiding van de geleidedraad (bijvoorbeeld het polijsten) is cruciaal. Daarom raden wij ten zeerste aan om de geleidedraadvoorbereiding te laten uitvoeren door gespecialiseerd technisch personeel waar beschikbaar.
Er zijn veel stappen voor het oplossen van problemen in dit protocol. Als de externe halsslagader in de buurt van de splitsing wordt ingesneden, bind dan voorzichtig de externa, in de buurt van de splitsing, zodat er geen bloeding optreedt. Tijdens het snijden is de externe halsslagader niet te zien. Overweeg daarom de splitsing op het niveau van zijdehechting. Verzamel secties wanneer de zijden hechting verdwijnt. Als de incisie in de externe halsslagader te groot is en het vat is gescheurd, zorg er dan voor dat de bloedstroom in de halsslagader en de interne halsslagader effectief wordt onderbroken en probeer de opening van het vat te vinden met behulp van tangen. Na de invoering van de geleidedraad en het uitvoeren van de denudatie, bind het vat in de buurt van de splitsing. Tijdens het snijden, beginnen te verzamelen wanneer de zijde van de hechting begint te verdwijnen. Als er tijdens de denudatie met de geleidedraad een arteriële breuk optreedt, controleer dan onder de microscoop of de geleidedraad goed is gepolijst.
Ondanks de gelijkenis van het draadletselmodel met klinische situaties, zijn veel groepen gericht op inheemse atherosclerose bij muizen, of kiezen ze voor invasieve atherosclerose-inducties, zoals ballonangioplastie bij ratten of konijnen, vanwege het gebrek aan opgeleid personeel dat kleine dierlijke operaties kan uitvoeren. Ondanks de voordelen van het gebruik van konijnen/ratten, bijvoorbeeld geen behoefte aan geminiaturiseerde apparatuur, bieden noch rattenmodellen noch konijnenmodellen een verscheidenheid aan verschillende knock-outstammen, in termen van het bestuderen van moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij neointimagroei en in-stenttrombose.
De bestaande modellen voor het bestuderen van in-stent restenose bij muizen zijn moeilijk, vereisen hoge chirurgische vaardigheden, en hebben een hoog risico op complicaties zoals bloeden of verlamming. Zo gaat de mechanische verwonding of stent-implantatie in de thoracale aorta via dijbeenslagader gepaard met een hoog sterftecijfer (35%) als gevolg van achterbeenverlamming of bloeden13-15. We beschrijven ook stent implantatie in de halsslagader van een muis16. De procedure is vergelijkbaar; de weefselverwerking voor analyse is echter ingewikkeld en is niet beschikbaar voor alle laboratoria16. De halsslagader is direct toegankelijk, niet alleen voor bedieningsprocedures, maar ook voor bestaande beeldvormingsmethoden zoals echografie. Andere letselinducties in de halsslagaders bij muizen kunnen worden gedaan met behulp van elektrische apparaten17. Deze methode is eenvoudig uit te voeren en zorgt voor een hoge reproduceerbaarheid. Het veroorzaakt echter letsel in alle vaatlagen, wat niet identiek is aan mechanische schade. Ballontoepassingen hebben voordelen, bijvoorbeeld de aanpassing aan de diameter van het vat in overeenstemming met de klinische praktijk en heeft een sterke invloed op de pathologische uitkomst. Hoewel muisballonnen beschikbaar zijn, zijn ze erg duur en daarom niet op grote schaal gebruikt. In plaats daarvan is de draad-letsel de gevestigde methode, het nabootsen van in-stent stenose.
De denudatie wordt uitgevoerd op de normale slagaderlijke wand, maar met een atherosclerotische achtergrond. Daarom zal de neointimavorming matig zijn in vergelijking met de klinische situatie. Het hoge aantal preklinische modellen toont aan dat geen van de modellen voldoet aan alle criteria die nodig zijn om het geheel van de cellulaire en moleculaire mechanismen die leiden tot de pathofysiologie bij de mens bloot te leggen (zie tabel 2).
Na het uitvoeren van de draadverwondingsprocedure kan andere biologische en moleculaire analyse worden uitgevoerd om cellen, eiwitten, mRNAs, microRNAs, genen of andere biomarkers te identificeren, die kunnen worden gebruikt als therapeutische doelen om nieuwe behandelingsstrategieën voor atherosclerose te ontwikkelen, en in het bijzonder voor neointimavorming na vasculaire schade. Indien beschikbaar, kan de plaque groei worden gecontroleerd met behulp van hoge frequentie echografie of andere hoge resolutie beeldvorming technieken. Bovendien zou het beheersen van deze techniek de operator de mogelijkheid geven om het protocol aan te passen aan andere invasieve atherosclerose-aansporingsmodellen, zoals halsbandplaatsing, gedeeltelijke ligatie of zelfs stentimplantatie.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek IZKF Aken (junior onderzoeksgroep tot E.A.L.) binnen de faculteit Geneeskunde van RWTH Aachen University. We danken mevrouw Roya Soltan ook voor hulp bij de immunohistochemie kleuring.
Materials
| Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | – |
| Forceps | FST, Germany | 91197-00 | standard tip curved 0,17 mm |
| Hemostat forceps | FST, Germany | 13007-12 | curved |
| Scissors | FST, Germany | 91460-11 | Straight |
| Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | – |
| Retractors | FST, Germany | 18200-10 | 2.5mm wide |
| Retractors | FST, Germany | 18200-11 | 5mm wide |
| Ketamine 10% | CEVA, Germany | – | – |
| Xylazine 2% | Medistar, Germany | – | – |
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | – | – |
| Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custom-made product | diameter 500µm, |
| section thickness 100 µm, | |||
| polytetrafluorethylene catheter | |||
| PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle |
| 7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | – |
| Michel Suture Clips | FST, Germany | 12040-01 | - |
| Clip Applying Forcep | FST, Germany | 12018-12 | - |
| 14”Wire for Catheter | Abbot | 1000462H | Use 10 cm from stiff part and equalize the ends |
| Mice | Charles River | Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background | - |
References
- Simsekyilmaz, S., Liehn, E. A., Militaru, C., Vogt, F. Progress in interventional cardiology: challenges for the future. Thromb Haemost. 113 (3), 464-472 (2015).
- Kubo, N., McCurdy, S., Boisvert, W. A. Defective Fas Expression on Bone Marrow Derived Cells Alters Atherosclerotic Plaque Morphology in Hyperlipidemic Mice. Discoveries. 3 (1), e37 (2015).
- Saffarzadeh, M., et al. Characterization of rapid neutrophil extracellular trap formation and its cooperation with phagocytosis in human neutrophils. Discoveries. 2 (2), e19 (2014).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. Mouse model of arterial injury. Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).
- Schwartz, R. S., et al. Preclinical evaluation of drug-eluting stents for peripheral applications: recommendations from an expert consensus group. Circulation. 110 (16), 2498-2505 (2004).
- Schwartz, R. S., et al. Restenosis and the proportional neointimal response to coronary artery injury: results in a porcine model. J Am Coll Cardiol. 19 (2), 267-274 (1992).
- Curaj, A., et al. Noninvasive molecular ultrasound monitoring of vessel healing after intravascular surgical procedures in a preclinical setup. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1366-1373 (2015).
- Liehn, E. A., Schober, A., Weber, C. Blockade of keratinocyte-derived chemokine inhibits endothelial recovery and enhances plaque formation after arterial injury in ApoE-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (10), 1891-1896 (2004).
- Liehn, E. A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C. Chemokines: inflammatory mediators of atherosclerosis. Arch Physiol Biochem. 112 (4-5), 229-238 (2006).
- Simsekyilmaz, S., et al. Role of extracellular RNA in atherosclerotic plaque formation in mice. Circulation. 129 (5), 598-606 (2014).
- Wu, Z., et al. Rhodamine-loaded intercellular adhesion molecule-1-targeted microbubbles for dual-modality imaging under controlled shear stresses. Circ Cardiovasc Imaging. 6 (6), 974-981 (2013).
- Schober, A., et al. Crucial role of the CCL2/CCR2 axis in neointimal hyperplasia after arterial injury in hyperlipidemic mice involves early monocyte recruitment and CCL2 presentation on platelets. Circ Res. 95 (11), 1125-1133 (2004).
- Ali, Z. A., et al. Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 833-840 (2007).
- Chamberlain, J., et al. A novel mouse model of in situ stenting. Cardiovasc Res. 85, 38-44 (2010).
- Rodriguez-Menocal, L., et al. A novel mouse model of in-stent restenosis. Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).
- Simsekyilmaz, S., et al. A murine model of stent implantation in the carotid artery for the study of restenosis. J Vis Exp. , e50233 (2013).
- Schroder, K., et al. NADPH oxidase Nox2 is required for hypoxia-induced mobilization of endothelial progenitor cells. Circ Res. 105 (6), 537-544 (2009).
