小鼠加速动脉硬化的诱导："电线损伤"模型

本文提出的实验是按照德国法律和欧洲动物护理指南进行的。这些动物是在德国亚森大学医院实验室动物科学研究所的动物设施中繁殖的，由托尔巴博士和Teubner博士（动物福利官员）监督。 1. 动物护理 将小鼠留在专门的护理室，确保适当获得食物，并进行专门的兽医控制和治疗。如果动物是移动或从第三方购买的，请确保在进行手术前有一周的住宿期。 2. 高脂血症诱导 喂养6 – 8周大，18 – 20克，雌性（可选）ApoE-/–小鼠 与异生饮食（21%脂肪，0.15%胆固醇，19.5%卡丁，wt/wt）在手术前一周，并继续节食，直到进行动脉硬化斑块分析。 3. 手术准备 使用内向注射100毫克/千克氯胺酮按体重和10毫克/千克基胺按体重麻醉小鼠。由于缺乏反射和胡须运动，在手术前确认正确的麻醉。在眼睛中放置少量无菌眼药膏，以尽量减少干燥。 确保保持无菌条件，避免在手术过程中使用无菌材料和仪器感染。 剃掉腹颈区域的小鼠。切口前用β丁消毒皮肤。在颈部区域的中位区域，在气管顶部进行 1 厘米的皮肤切口。 分离两个脂肪体，以确保对气管区域的正确视图。使用缩回器保持肌肉层并暴露肌动脉。如果存在，则对覆盖胡萝卜状动脉的薄肌肉层进行钝解剖。 使用锋利的弯曲钳子将胡萝卜动脉与迷走神经和血管分开。因此，与内部和外部胡萝卜动脉的分叉区域应可见。使用0.9%NaCl，以避免手术过程中组织干燥。 4. 电线伤害 将7厘米长的0/5丝线在胡萝卜动脉下，与主动脉拱门近在一起。使一个开放循环，随时可以关闭。 在外胡萝卜动脉周围放置两根 0/7 丝线（每根 1.5 厘米长）：一个环靠近分叉点，一个环尽可能不长。将它们准备为开放循环，随时可以关闭。 将一个0/7丝缝合线（1.5厘米长）放在内皮蒂德动脉下。准备它作为一个开放循环，随时可以关闭。 将鼠标头的鼠标表朝向操作员，以确保在拆卸期间正确定位导丝插入（图 1A）。 在微观视野下，通过用血钳抓住和拉扯0/5丝线状的末端，阻止血液流经普通心肌动脉。 在常见的胡萝卜状动脉连结后，立即关闭放置在内胡萝卜状动脉上的缝合环和外胡萝卜动脉上的外部动脉的外部缝合线（图1B）。 使用小剪刀在两个回路之间，在两个回路之间，对外部胡萝卜动脉进行小切口（动脉切除术，血管直径的一半）（图1C）。如果切口太大，请按照故障排除说明操作（请参阅讨论）。 使用商业抛光导轨线或使用内部专门人员抛光导轨。用酒精消毒 14 英寸抛光柔性导丝，并在 0.9% NaCl 液滴中润湿，以确保正确滑入容器。 通过外部胡萝卜动脉的横向动脉切除术将导丝插入普通胡萝卜动脉（图1D）。在旋转时沿导丝穿过导丝，获得内皮变性。重复此过程三次。在每只鼠标中保持相同的旋转运动幅度，以提高可重复性。 紧闭外胡萝卜动脉上的近向回路。通过切断普通动脉周围的缝合线和内胡萝卜动脉周围的缝合线，恢复心肌动脉的血液流动。 5. 缝合和恢复 取出缩回器，将肌肉层和两个脂肪体返回到生理位置。 如果需要超声心动测量，请用三个分离的缝合线0/6关闭皮肤。如果不需要成像，请使用金属夹子关闭皮肤。 将鼠标放在其左侧的红外光下，直到它醒来。在完全康复之前，不要让动物无人看管，也不要与其他动物在一起。 对于将来的标识，请使用本地系统标记鼠标。向当地机构的动物福利官员询问。 6. 动脉硬化斑块分析 在结束时间点麻醉小鼠使用内向注射100毫克/千克氯胺酮的体重和10毫克/千克木酸按体重。缺乏反射和胡须运动，确认正确的麻醉。 通过复古轨道或心脏穿刺进行排泄，并收集血液作进一步分析2。 用贝塔丁消毒皮肤。打开胸腔，取出心脏的右牙。磷酸盐缓冲溶液通过左心室去除血管中剩余的血液，然后用4%的PFA来修复组织。 如果不需要固定，洗涤2，4，11后立即清洗胡萝卜动脉。执行标准协议，分析感兴趣的：石蜡嵌入，低温，mRNA或蛋白质分析等。 对于形态测量，小心地将胡萝卜动脉（包括分叉）外化，只需最少的操作，即使用弯曲钳子和小剪刀近到主动脉拱。 使用标准嵌入协议将胡萝卜状动脉嵌入石蜡块中。要执行横向剖面，请将胡萝卜动脉直立在分叉上。切5 μm 厚的串行部分，从分叉开始，将它们全部收集在涂层组织学幻灯片上（图 2A）。 每10节染色 使用移动染色，以突出拉米纳斯2，4，11。收集所有容器的微观图片（使用 10 倍目标）后，使用特殊设计的软件2，4，11 测量流明，以及每个部分的内部和外部层压，如图 2B 所示。计算容器的刺激生长和介质。 使用通常的免疫病理学染色2（ 图2C）分析平滑肌细胞和巨噬细胞含量，或连续部分的内皮恢复。