pH bağımlı aktivitenin tespiti<em> Escherichia coli</em> Chaperone HdeB<em> İn Vitro</em> ve<em> İn Vivo</em

Mikrobiyal patojenler asit kaynaklı protein elinde tutmasına koşulları tecrübe edildiği bir ortak doğal çevre olan asidik pH gıda kaynaklı patojenler ¹ karşı etkili bir bariyer görevi görür memeli mide (pH aralığı 1-4) 'dir. Amino asit yan zinciri protonasyon nedeniyle protein açılması ve agregasyonu, biyolojik süreçleri, zarar hücresel yapıları etkileyen ve en sonunda hücre ölümüne ^1,2 neden olur. Bakteriyel periplazmaya pH nedeniyle gözenekli dış zar boyunca proton serbest difüzyonuna neredeyse aynı anda, çevre pH dengeye için, Gram-negatif bakterilerin periplazmik ve iç membran proteinleri asit, gerilimli şartlar altında ³ en hassas hücre bileşenleri bulunmaktadır. Hızlı asit aracılı olduğu hasarlara karşı gösterdikleri periplazmik Proteomun korumak için, Gram-negatif bakteriler asit ile aktive edilmiş periplazmik şaperonlar HdeA ve HdeB kullanmaktadır. HdeA bir şartlı bozukluğu şaperonudur <sup> 4,5: nötr pH'da, HdeA katlanmış, şaperon hareketsiz dimer olarak mevcuttur. PH 3 altında bir pH kayması sırasında, HdeA en şaperon fonksiyonu hızla ^6,7 etkinleştirilir. HdeA aktivasyonu monomerlerin ^6-8 açılımı derin yapısal monomerlerin içine ayrışma dahil değişiklikleri, ve kısmi gerektirir. Bu işlemden sonra, HdeA asidik koşullar altında açığa proteinlerine bağlanır. Bu etkili bir düşük pH değerlerinde inkübasyon sırasında hem de pH nötrleştirme sırasında hem agregasyonunu engeller. PH 7.0'a dönüş üzerine, HdeA bir ATP-bağımsız bir şekilde, istemci proteinlerinin yeniden katlanmasını kolaylaştırır ve dimerik, refakat-olmayan yapıya ⁹ geri dönüştürür. Benzer şekilde, benzer şaperon HdeB da refakat hareketsiz pH 7.0 ile kullanılmıştır. HdeA aksine, HdeB en şaperon aktivitesi, pH 4.0 HdeB hâlâ büyük oranda katlanır ve ¹⁰ dimerik olduğu koşullar altında, görünür maksimuma ulaşır. Ayrıca, daha fazla pH gevşeyebilir düşürücüHdeB inaktivasyonu es. Bu sonuçlar, büyük bir homoloji rağmen HdeA ve HdeB bunları koruyucu şaperon fonksiyonu ile geniş bir pH aralığı kapsayan sağlayan fonksiyonel bir aktivasyon tarzı açısından farklılık göstermektedir. E. asit direnci implike edilmiştir Diğer bir şaperon E. coli nötr koşullar restore kadar gelişeceğini istemci proteinleri stabilize görünen sitoplazmik Hsp31 vardır. Hsp31 en müdahale durumu net olarak, bununla birlikte, ¹² anlaşılmaz kalmıştır. Salmonella gibi diğer enteropatojenik bakteriler hdeAB operonunu eksikliği göz önüne alındığında, diğer henüz kimliği belirlenemeyen periplazmik şaperonlar bu bakterilerin ¹¹ asit direnci dahil olduğunu var olabilir kuvvetle muhtemeldir.

Burada yer alan protokol vivo ¹⁰ in vitro ve in HdeB pH bağımlı şaperon etkinliğini izlemek için izin diğer şaperonlar araştırmak için uygulanabilirHsp31 gibi. Seçenek olarak ise, hdeAB ifadesini kontrol transkripsiyon faktörleri karmaşık ağ potansiyel in vivo gerilme testi ile araştırılabilir. In vivo olarak, proteinlerin şaperon işlevini karakterize etmek için, farklı deney düzenekleri uygulanabilmektedir. Birinci yol proteinin açılımı stres koşullar uygulanır ve fenotipik iki ilgili geni aşırı ifade eden ya da genin bir silme taşıyan mutant türünü nitelendirilmesidir. Proteomik çalışmalar chaperone mevcut olduğu zaman, gerilimli şartlar altında, toplam artık bu proteinleri belirlemek için yapılabilir, ya da belirli bir enzimin bir şaperon etkisi Enzimatik ^14-16 kullanılarak stres şartlarında belirlenebilir. Bu çalışmada, tüm büyük E. ekspresyonunu kontrol RpoH ısı şoku sigma faktörü 32. yoksun bir rpoH delesyon suşu içinde HdeB aşın tercih E. coli chaperones ve silme sens arttırdığı bilinmektedirprotein ¹⁵ açılımı neden olan çevresel stres koşullarına iTivity. HdeB in vivo şaperon aktivitesi Δ rpoH soyunun pH duyarlılığı bastırmak için kabiliyetini izleyerek tespit edilmiştir. Özet olarak, burada sunulan protokoller in vitro hem de in vivo bağlamında bir asit ile aktive edilmiş cinsten aktivitesinin karakterize edilmesi için hızlı ve basit bir yaklaşım sağlar.