Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

1.細胞の回収および凍結関心25,26の細胞株のための適切な培養条件を用いて細胞材料1-8 gで成長します。このプロトコルは、参考文献19,27,28から改変された細胞の最大8グラム（〜10 9細胞）、最適化されています。典型的には、約5 gをHEK-293またはヒーラ細胞が約90％コンフルエントまで増殖8 500 cm 2の培養プレートから得ることができます。 注意：これらのプロトコルは、重度の低温やけどを引き起こすことができる液体窒素（LN 2）を使用します。ドン・保護服と適切な取り扱い上の注意を行使する。 大きなビーカーに成長培地（廃棄物）をオフに注ぎます。 大きな長方形の氷皿に氷の上で培養皿を置きます。 培養皿に氷冷1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の20ミリリットルを追加し、大細胞スクレーパーを用いて皿から細胞を放出。氷上で予冷し、50ミリリットルチューブに細胞を移します。チューブを氷上に保持します。 注意：すべてのセルの取り扱い手順については転送操作の間に細胞の過剰な剪断を回避するために、「低」と25ミリリットルピペットに設定した電気ピペッターを使用しています。 50ミリリットル収集チューブを手配し、前の手順を開始するアイスバケットにPBSを1倍。 同じ皿に氷冷1×PBSの追加の10ミリリットルを追加します。残りの細胞を収集し、50mlチューブに移します。 各皿のために繰り返します。別の皿からの細胞懸濁液は、サンプル数やプラスチック廃棄物を減らすために組み合わせることができます。 注：細胞自体は懸濁液体積の大部分を構成しないので、細胞懸濁液の価値三板は、2つの50mlチューブに組み合わせることができます。 50ミリリットルチューブは実際に名目上の量よりも多くを保持しているので、8枚のプレートは、一般的に5などのチューブに分散させることができます。 1,000×gで5分間遠心分離し、4℃。 上清を慎重に取り除きます。 10ミリリットルの氷冷1×PBS中で各ペレットを再懸濁します。 RESUを統合サンプルの数を減らすために、50mlチューブ当たり5まで、ペレットをspended。 千×gで、4℃で5分間遠心。 上清を慎重に取り除きます。 10ミリリットルの氷冷1×PBSでペレットを再懸濁 20ミリリットルのシリンジからプランジャーを取り外し、脇に置きます。注射器のノズルをキャップとそれに細胞懸濁液を転送します。 千×gで、4℃で50mlのチューブと遠心分離機5分の内側に注射器を置きます。 細胞のちょうど上部層が吸い上げされ始めるまで、真空トラップシステムに取り付けられた先端の細いピペットで上清を吸引除去します。これは、湿った細胞ペレットになります。 プランジャーを挿入し、発泡スチロールの箱でLN 2浴で開催されたLN 2を充填した大規模なプラスチックビーカー、中に直接細胞を滴下、注射器をキャップを取ります。強制的にシリンジから残りの細胞を急落。 注ぐことにより、50mlチューブに凍結細胞を転送します。ゆるく過剰LN 2が蒸発することを可能にするチューブをキャップ。トンを開催-80℃での裾一晩。翌日、完全にキャップを締めます。凍結した細胞は、低温ミリングまで-80℃で、このように記憶されてもよいです。 注：すべてのLN 2が目に見えて蒸発する前にしっかりとそうでない場合は、過度の圧力が管が爆発する恐れがあり、チューブを閉じないでください。 LN 2が消失した後、チューブを閉鎖しないと、過剰な水の量を添加して効果的に粉砕時にタンパク質濃度を減少させる、細胞材料の霜の蓄積をもたらすことができます。 凍結細胞の2極低温破壊注：粉砕及び操作のためのすべてのツールは、LN 2を事前に冷却する必要があります。小さなデカンタは、瓶の中にLN 2を追加すると、閉じた製粉ジャーの上にLN 2を注ぐために必要とされるであろう。自家製のツールは、参照19に示されています。極低温グローブ粉砕装置を冷却LN 2を処理するために必要とされます。フライス加工ここで使用される瓶の蓋は、一般的にインストールされてゴムパッキンに同梱（ 材料の表を参照のこと）。これは、確実に次のプロトコルを実行するために、市販のテフロン蓋ガスケットに交換する必要があります。気体状のN 2からの圧力は、粉砕中瓶内の高レベルまで構築することができますので、また、私たちは安全リリース対策28として市販されている5バー/ 500キロパスカルの圧力弁を設置することをお勧めします。 -80℃の保存から細胞ビーズを除去し、LN 2浴中に50ミリリットルチューブホルダーに保持します。 LN 2を含むきれいな長方形のアイスバケットに50ミリリットルの瓶、2 20ミリメートルボール、および蓋を事前冷却します。 1を使用する場合はポリテトラフルオロエチレン（PTFE）絶縁体を事前冷却;パックのセット（27を参照する参照）、またはスリーブ・アンド・パック（ 図2を参照）のいずれか。事前冷却が完了すると、LN 2落ち着かの暴力的な沸騰。 上の適切なカウンターバランスを設定しますミル。 注：これは瓶の質量、瓶のふた、使用されている粉砕用ボール、ジャーに追加する細胞の量と同じになります。任意のPTFE絶縁体を使用している場合は、それらの質量も含まれるべきです。私たちは事前に瓶、蓋、および（使用される任意の絶縁体を含む、それらの合計質量、）ボールの質量を記録し、工場の近くに格納された情報シート上に記録を示唆しています。 ピンセットを使用して、2つの予備冷却の20mMミリングボールと予め冷却ミリングジャー内部の凍結細胞を置きます。 注：これにより、ミリング中瓶、ボール表面上の材料の小さな損失のため、増加粉砕された細胞の塊として回収された物質の割合が増加します。記載の方法により、材料損失が〜0.3グラムのウェット細胞重量（WCW）の順であること、非常に控えめです。メーカーのガイドラインでは、サンプルの最大容量は、ジャーボリュームの〜1月3日であるべきロードを示しています。 29ボールの総容積は〜1月3日とrであるべきですemaining〜1月3日の空き領域がボールの自由な移動のためのものです。 〜½完全にジャーまでにLN 2を追加し 、瓶に蓋を配置し、ミルにアセンブリを転送します。 注：1を使用している場合、最初に選択された絶縁体を取り付けます。 場所にアセンブリをクランプし、次のプログラム使用して製粉の3つのサイクルを実行します。400回転、3分、逆回転を毎分、無区間の区切りを。各サイクルの間にLN 2と製粉ジャーを冷却します。 注：ボールが惑星運動で瓶内の衝突のように明確なclunkingノイズが生成される粉砕中。これらの音は聞かれていない場合は、粉砕が発生していません。フライスサイクルを終了し、このサイクルをカウントバックLN 2にジャーアセンブリを移動し、jarファイルの内容を調べていません。何の氷が形成されず、それが持っている場合、予め冷却したスパチュラでジャー壁からそれを離れてチップしていることを確認します。ステップ2.5から再び起動します。 全くの絶縁体または絶縁体のパックを使用していない場合は、に戻っジャーアセンブリを移動LN <sサイクル間の> 2 UB-涼しい再と〜½完全にするたびにLN 2を追加します。追加されたLN 2は 、ミリング中に瓶の温度が上昇するように瓶の中に蒸発します。これは、瓶内の圧力上昇をもたらします。工場からjarを外すときしたがって、非常にゆっくりとクランプを解放します。クランプが急速に放出された場合、細胞粉末は、急速減圧して逃げることができます。クランプの徐放は、圧力が穏やかな、制御された形で瓶から脱出することを可能にし、細胞材料の損失を防ぎます。これは正常です-気体状のN 2の穏やかなエスケープは、多くの場合、クランプがゆっくりと放出されるようヒス聞くことができます。 スリーブ・アンド・パックの絶縁体を使用する場合は、ジャーアセンブリはミルに残され、LN 2は、 その場で 、絶縁体/ジャーアセンブリに加えることができます。 バックLN 2にjarファイルを移動し、冷却するために一時的に休ませて。スリーブ・アンド・パックの絶縁体を使用する場合、瓶スリーブWから除去することができます2へらの助けi番目の、いずれかの側にレバレッジを提供します。瓶はLN 2で休んされたら、慎重にピンセットを使ってボールを削除し、ふたを取り外し、予め冷却したスパチュラを用いて予め冷却した50ミリリットルチューブに粉末を移します。オープン瓶/粉末に少しLN 2を追加すると、それらを削除する前に、ボールの上にこびりついされる粉末を除去するのに役立ちます。 注：jarファイルが開かれた後、ボールを取り外す前に、それにLN 2を少量加えます。これは、表面にこびりつい粉末を回復するのに役立ちます。細胞粉末は、-80℃で、または下記の使用まで保持してください。我々の経験では、細胞粉末は、性能に影響を与えることなく、本質的に無制限に、この方法で保存することができます。 細胞抽出物からのタンパク質複合体の3アフィニティー捕捉注：以下のプロトコルは、目的のタンパク質と相互作用する親和性リガンド、餌、または抗体からなるアフィニティーメディアを実装し、共同ミクロンスケールの常磁性ビーズにupled。これらは、市販のキットを使用して、社内19,30調製、または既製の試薬として購入することができます。 細胞抽出物の準備注：セルの粉末を取り扱うときは、LN 2で予備冷却調理器具やチューブを使用することを忘れないでください。細胞粉末を含むチューブは必ずしもないときは、-80℃でLN 2に開催されるべきです。 LN 2と発泡スチロールの容器に、チューブのラックに細胞粉末を含む50 mlチューブ（複数可）を配置します。 1.5または2ミリリットルの微量遠心チューブに細胞粉末100mgを秤量。 注：我々は、細胞のこの量は、通常、ナノグラム数十〜数百中の標的タンパク質をもたらす良い出発点があるあたりのコピー数千で、適度に発現されたタンパク質（〜50 kDaの質量のためのアフィニティー捕捉した後に現在のレンジことを観察しましたターゲットの抽出と捕獲効率を推定セル）は、≳70％です。このような収率は直接visualizを提供しますSDS-PAGE及びタンパク質染色による精製画分のエーション。 空のマイクロチューブと風袋分析天びん。スプーンやへらを冷却LN 2を使用してチューブに細胞粉末を分注します。化学天秤でチューブ内に分配さ粉体の質量を確認してください。 注：細胞粉末の秤量を容易にするために、小さな容積測定スプーンを使用してもよいです。これらは、（19を参照する参照）、再現性のある結果を与えることが見出されています。私たちは、スクリューキャップまたは「安全ロック」マイクロ遠心チューブを使用して最良の結果を発見しました。チューブに入ることがLN 2を蒸発させてからの圧力は、標準的なマイクロ遠心管が直前に抽出溶液の添加後に温暖化時にオープンポップする可能性があります-潜在的にサンプルの損失が生じます。 チューブを開きます（またはスクリューキャップを緩め）細胞粉末とし、1分間室温で放置。これは、チューブ内の圧力を解放し、抽出の即時凍結を防止します粉末に添加ソリューション。いいえ解凍はこの1分間のインキュベーションの間に観察されません。 3.1.5に進みながら、氷上で保持した後、プロテアーゼ阻害剤と簡単に渦を補った抽出剤の400μLを加えます。サンプルは、溶出するまで、後続のすべての操作の間に氷上に保持する必要があります。 注：抽出の最良の組成物を精製するタンパク質複合体（複数可）に依存します。いくつかの一般的なガイダンスについては、 表1と支持参考文献において提供されます。 サンプルを任意の凝集体を分散させるための簡単な低エネルギーパルスを与えるためにマイクロチップ超音波装置を使用してください。 4パルス（;総エネルギーの約15-20 J 2秒ずつ、2 A）と（ウルトラ）超音波処理。 注：ボルテックスは、抽出剤への細胞の粉末を分配するが、溶液の文字に応じて、いくつかの凝集体が観察されてもよいです。私たちは、これらの凝集体を分散させることは、その後の親和性捕捉時の最高の収量を提供することを見出しました。簡単なマイクロチップSONI陽イオンは、簡単にこれらの凝集体を分散させます。解決策は、明らかな凝集体をなし、半透明のが、均質で表示されます。水浴超音波処理を効率的に有意に長いサンプル処理時間をすることなく、このような凝集体を分散させるには余りにも低消費電力をする傾向があるが、適切な設定で適切であり得ます。 遠心分離により抽出液を明確に（ 例えば20,000×gで、10分間、4℃）。 注：清澄細胞抽出物のアリコートをペレット、後アフィニティー捕捉上清の内容と比較するために保存することができ、アフィニティ媒体からの溶出後に得られた画分は、標的タンパク質の抽出の効率および捕捉を決定します例えば、ウェスタンブロットにより（説明を参照）。 上清（清澄化抽出物）を取り外し、アフィニティー捕捉に進みます。 注：ペレットが標的タンパク質Dの放出の程度を決定するために、70℃でSDS-PAGEサンプルローディング緩衝液中に再抽出することができますステップ3.1.6で得られた抽出物と比較することにより、最初の非変性抽出をuring。 アフィニティキャプチャ 磁気親和性媒体を予洗。細胞抽出物を遠心している間に行われることができます。 磁石上にチューブ（複数可）を配置します。ビーズを除去するストレージソリューションを可能にする、数秒以内に管の側面に蓄積します。 ビーズに抽出溶液500μlを追加します。中速で短時間ボルテックスミックス（再懸濁させるのに十分な）。底にすべてのコンテンツを収集するためのミニ遠心機でチューブをパルススピン。そうすることでソリューションの最小キャリーオーバーを保証します。磁石上にチューブを置き、ソリューションを吸引します。 注：独特の特性を持つ磁気メディアは商業的供給業者の多種多様から入手可能です。結果は、ビーズの大きさ、均一性、表面コーティング、および抗体結合化​​学を含む、これらの特性に依存して変動し得ます。サイド・バイ・SIアプリケーションのデ試験は選択試薬に定住する前に、推奨されています。 再懸濁するために簡単に予め洗浄した親和性媒体と渦を含む1.5から2.0 mlのチューブに清澄化した細胞抽出液を転送することにより、親和性捕捉を開始します。 回転子ホイール上に連続穏やかに混合しながら4℃で30分間インキュベートします。ビーズは、インキュベーション全体で停止されたままにする必要があります。 チューブの底にすべてのコンテンツを収集するためのミニ遠心機でチューブをパルススピン。上清を吸引し、ステップ3.2.3に記載のように冷抽出溶液1mlでビーズを3回洗浄します。磁石上にチューブを入れます。溶液を除去。次のソリューションを追加し、繰り返しに進みます。 2 回目の洗浄中に、ピペットで新たなマイクロチューブに一緒にビーズや洗浄溶液を移します。これは、Tとのインキュベーションのために使用されるチューブの壁に吸着ランダムタンパク質により、溶出の時点で、サンプルの汚染を減少させます彼は、抽出物を細胞。 3 回目の洗浄の後、ビーズが底にすべての内容を収集するために、ミニ遠心機にパルス紡糸簡単であるべきです。背面磁石にチューブを置き、すべての残留液体を除去します。これは、溶出均一なボリュームを持つことになり溶出したサンプルを確保する前に、ソリューションの最後の数マイクロリットルの除去を可能にします。また、溶出溶液は、残留洗浄によって希釈されることはありませんように溶出は、有効であることが保証されます。このような残基は、（下記参照）の塩効果に寄与し、SDS-PAGEにおけるタンパク質の移動を変化させることができます。 注：結合後の上清のアリコートは、3.1.6で生成された清澄化抽出物との比較のために保存することができます。ウェスタンブロットによる。結果は、細胞抽出物から標的タンパク質の枯渇の程度を示します。 いずれかのネイティブまたは変性の方法で溶出。下流側のアプリケーション1のための最善の戦略を検討してください。 注：ネイティブ溶出ストラテジーの詳細sが使用される親和性タグ（説明を参照）に依存することになります。タンパク質染色31でSDS-PAGEにより試料の分析に続いてSDS-PAGE試料緩衝液で溶出変性ほとんどのユーザーのために、最も実用的な最初のアプローチであろう。 注：サンプル緩衝液の組成は、使用される電気泳動システムに依存するであろう。多くのラボでは、不連続電気泳動およびLaemmliバッファーシステム32-34を利用して、自分のトリス-グリシンゲルをキャスト。一般的なサンプルバッファレシピ（1X）を含む10％のスクロース、50mMのDTT、2％ブルーSDS（​​w / v）の、62.5 mMのトリス-Cl pHは8.8、0.0004％（重量/ v）のブロモフェノール31（w / v）の。私たちは、DTTを省略し1.1倍の株式を準備することをお勧めします。 500mMのDTTの量はSDS-PAGEの前にサンプルに添加されるべき第 1/10（下記参照）。多くの市販のSDS-PAGEシステムもご利用いただけます。これらは、システム固有のサンプル・バッファを含むことができます。 放出を軽減する（還元剤なしでSDS-PAGEサンプルバッファーを加えますビーズからの抗体鎖の）と攪拌しながら、室温で5〜10分間インキュベートします。 注：これは上清中に捕捉されたタンパク質を放出し、最も親和性に基づく相互作用を妨害します。より永続的な相互作用は、（典型的には70°Cで十分である）放出のための高温から利益を得ることができます。 上清を収集し、保存します。サンプルは、（数日）の簡単な保存のために-20℃で凍結してもよいし-80拡張記憶のためのC°分析が望まれるまで。 標準的な技術31を用いて、タンパク質染色に続いてSDS-PAGEにサンプルを供します。 MSは、試料組成物1を特徴付けるために使用することができます。個々のタンパク質バンドは、識別のために切除しても良いし、試料全体を短時間だけ（ゲルに4〜6ミリメートル）サンプルを電気泳動し、として一緒に、試料中の全てのタンパク質を処理することによって、1回の分析で特徴づけることができる「ゲルプラグ」。 注：イニシア前にDTTを追加ティン電気泳動。 MSに進むことを計画している場合、サンプルは、電気泳動の35の後にアルキル化することができます。しかし、それは電気泳動前36にアルキレートに頻繁に便利です。