JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Published: December 09, 2016
doi:
10.3791/54518
, ,
1Laboratory of Cellular and Structural Biology,The Rockefeller University, 2Institute for Systems Genetics, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology,New York University School of Medicine

Summary

Hier beschrijven we protocollen bij zoogdiercellen door solid-state frezen verstoren bij een cryogene temperatuur, produceren een cel uittreksel uit de resulterende cel poeder, en te isoleren eiwitcomplexen van rente door affiniteitsinvangmiddel upon-antilichaam gekoppeld micron-schaal paramagnetische kralen.

Abstract

Affiniteitsinvangmiddel is een effectieve techniek voor het isoleren van endogeen eiwit complexen voor verdere studie. Bij gebruik in combinatie met een antilichaam, wordt deze techniek ook vaak aangeduid als immunoprecipitatie. Affiniteitsinvangmiddel kunnen worden toegepast in een bench-schaal in een high-throughput context. In combinatie met eiwit massaspectrometrie heeft affiniteitsinvangmiddel bewezen een werkpaard van interactoom analyse. Hoewel er vele manieren mogelijk om de vele stappen die voeren, de volgende protocollen voeren stappen gunstig methoden. Twee kenmerken zijn kenmerkend: het gebruik van cryomilled celpoeder om celextracten en antilichaam gekoppeld paramagnetische korrels produceren als het affiniteitsmedium. In veel gevallen hebben wij uitstekende resultaten met die verkregen met conventionelere affiniteitsinvangmiddel praktijken. Cryomilling vermijdt vele problemen verbonden met andere vormen van celbreuk. Het zorgt voor een efficiënte breuk van het materiaal, terwijl het vermijden denatfiguratie kwesties in verband met het verwarmen of schuimen. Het behoudt de natuurlijke eiwit concentratie tot het punt van de winning, verzachtende macromoleculaire dissociatie. Het vermindert de tijd geëxtraheerde eiwitten in oplossing te brengen, beperken schadelijke enzymatische activiteiten, en het kan de niet-specifieke adsorptie van eiwitten te verminderen door het affiniteitsmedium. Micron-schaal magnetische affiniteit media hebben meer gemeengoed in de afgelopen jaren uitgegroeid tot steeds meer ter vervanging van de traditionele agarose- en Sepharose-based media. Belangrijkste voordelen van magnetische media omvatten meestal lagere niet-specifiek eiwit adsorptie; geen size exclusion limiet omdat eiwitcomplex binden vindt plaats op de korrel oppervlak in plaats van binnen de poriën; en het gemak van manipulatie en handling met behulp van magneten.

Introduction

Een typische toepassing van de gepresenteerde procedures te stabiliseren en het verkrijgen van een hoge opbrengst en zuiverheid van endogene eiwitcomplexen plaats voor interactomic karakterisatie 1. Het is duidelijk dat dynamische netwerken zowel stabiel en transiënt bijbehorende macromoleculaire complexen, voornamelijk bestaande uit eiwitten, cellulaire processen orkestreren 2,3. Hoewel er vele experimentele benaderingen voor het identificeren van eiwit-eiwitinteracties, affiniteitsinvangmiddel is een van de meest gebruikte methoden voor het isoleren en ontleden fysiologische eiwitcomplexen 4-6. Bovendien heeft deze techniek het voordeel van de opbrengst macromoleculaire complexen fysieke entiteiten, niet alleen als datapunten in een read-out; Met voordeel kan de verkregen complexen dus worden gebruikt in een groot aantal extra downstream biochemische, enzymatische en structurele analyses 7-9. De gepresenteerde protocollen zijn ontwikkeld als antwoord op de behoefte in kaart Protein-eiwit interactie netwerken en karakteriseren van macromoleculaire complexen in hun rol als de effector moleculen van celbiologie. Ze zijn gedetailleerd met betrekking tot hun toepassing zoogdiercellen gekweekt in weefselkweek, maar is evenzeer toepasbaar op een breed scala van biologische monsters een passende systeemspecifieke aanpassingen.

De geschiedenis van affiniteitsinvangmiddel gaat terug tot het begin van de twintigste eeuw met de eerste immuno-chromatografie experimenten – die lijkt op wat gewoonlijk wordt tegenwoordig aangeduid als immunoprecipitatie (IP) – te zien zijn in de literatuur van de vroege jaren 1950. Mainstream gebruik van de techniek verder ontwikkeld door middel van het begin van deze eeuw tot heden 10-13. Diverse cel- en moleculair biologische studies mechanische breuk van cellen gebruikt door het malen bij cryogene temperaturen gedurende ten minste de laatste veertig jaar 14-19; en moleculaire scheidingen gebruik te maken van (super) paramagnetische kralen become steeds vaker in de afgelopen twee decennia 20. De combinatie van deze verschillende technologieën heeft gediend om synergetisch de resultaten die in eiwitcomplex affiniteitsinvangmiddel experimenten 1 kan worden verkregen te verbeteren, zoals blijkt uit een uitgebreid oeuvre geproduceerd door onszelf en de bredere onderzoeksgemeenschap 7,9,11,18,19,21 -23. Ondersteunende resultaten zijn weergegeven in Figuur 1.

Een verzameling van waarschuwingen en overwegingen van toepassing zijn op het uitvoeren van effectieve affiniteitsinvangmiddel experimenten kan worden gevonden in referentie 1. Typisch deze aanpak het meest geschikt is om: (I) de catalogus van de interactors van een eiwit van belang, dat wil zeggen, gebruik maken van eiwit massaspectrometrie (MS) tot dusverre onbekende copurifying eiwitten (verkennende analyse) te identificeren; (II) assay voor de aanwezigheid van een specifieke interagerende partner, bijvoorbeeld, gebruik MS of western blot met een bepaald eiwit of een beperkt aantal eiwitten vermoedelijk detecteren ininterageren met het eiwit van belang (hypothese testen); of (III) te bereiden endogeen geassembleerd eiwitcomplexen die het eiwit van belang voor verdere studie door aanvullende technieken (preparatieve opwerking). Alvorens een affiniteit capture experimentele regime is het absoluut noodzakelijk om een ​​hoge kwaliteit affiniteit reagens dat bindt aan het doelwit eiwit, meestal een IP-bevoegde antilichaam tegen het natieve doelwit eiwit van belang of tegen een tag toegevoegd aan een fusie-eiwit te hebben. Het is ook van cruciaal belang om de juiste methoden van experimentele uitlezing op zijn plaats: algemeen eiwit kleuring (zoals Coomassie blauw, Sypro Ruby, of zilver, na SDS-PAGE), western blotting, en eiwitten MS worden allemaal vaak gebruikt in combinatie met affiniteit capture 1. De gepresenteerde protocollen gebruiken antilichaam geconjugeerde magnetische kralen als het affiniteitsmedium. Hoewel de functie van het affiniteitsmedium initieel worden gevalideerd tests die enkele experimentele parameters gebruiken omverkrijgen van de beste resultaten elk experiment moeten empirisch worden geoptimaliseerd 1,11,24. De protocollen zijn onderverdeeld in drie verschillende fasen: (1) bereiding van ingevroren celmateriaal; (2) cel breuk door solid state frezen bij cryogene temperatuur; en (3) eiwitextractie en affiniteitsinvangmiddel middels antilichaam gekoppeld paramagnetische kralen.

Protocol

1. Cell Oogst en Vriezen Grow 1-8 g celmateriaal met de juiste kweekomstandigheden voor de cellijn van belang 25,26. Dit protocol is geoptimaliseerd voor maximaal 8 gram cellen (~ 10 9 cellen), modificatie van referenties 19,27,28. Gewoonlijk ~ 5 g HEK-293 en HeLa-cellen kunnen worden verkregen uit acht 500 cm 2 kweekplaten gekweekt tot ~ 90% confluentie. LET OP: Deze protocollen gebruiken vloeibare stikstof (LN 2), kunnen veroorzaken ernstige cryogene brandwonden. Don beschermende kleding en lichaamsbeweging gepaste voorzorgsmaatregelen. Giet het groeimedium (afval) in een grote bak. Plaats de cultuur schotel op het ijs in een grote rechthoekige ijs pan. Voeg 20 ml ijskoude 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de kweekschaal en de cellen uit het schaaltje met een vrij grote cel schraper; overbrengen van de cellen naar een 50 ml buis, vooraf gekoeld op ijs; Houd de buis op ijs. NOTITIE: Voor alle mobiele handling stappen maken gebruik van een elektro-pipet ingesteld op "laag" en 25 ml pipetten aan overmatige afschuiving van cellen tijdens de overdracht manipulaties te voorkomen. Schik 50 ml collectie buizen en 1x PBS in een ijsemmer voorafgaand aan de inleiding van de procedure. Een extra 10 ml ijskoude PBS 1x naar dezelfde schotel. Verzamelen van de overblijvende cellen en overbrengen naar de 50 ml buis. Herhaal dit voor elk gerecht; celsuspensies van verschillende gerechten kunnen worden gecombineerd om sample nummer en plastic afval te verminderen. OPMERKING: Omdat de cellen zelf een groot deel van de suspensie volume niet zal vormen, kunnen drie platen waarde celsuspensie worden gecombineerd tot twee 50 ml buisjes. Omdat 50 ml buisjes eigenlijk meer dan het nominale volume te houden, kan acht platen doorgaans worden verspreid over vijf van dergelijke buizen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1000 xg, 4 ° C. Giet voorzichtig de supernatant. Resuspendeer elk pellet in 10 ml ijskoude 1x PBS. Consolidatie van de resuspended pellets, maximaal 5 per 50 ml buis met monsternummer verminderen. Centrifugeer 5 minuten bij 1000 xg, 4 ° C. Giet voorzichtig de supernatant. Resuspendeer de pellet in 10 ml ijskoude PBS 1x Verwijder de zuiger uit een 20 ml spuit en leg het opzij. Cap het mondstuk van de spuit en breng de celsuspensie aan. Plaats de spuit in een 50 ml buis en centrifugeer 5 min bij 1000 x g, 4 ° C. Zuig het supernatant met dunne stift pipet tot enkel de bovenste laag van cellen gehecht aan een vacuum val systeem begint te worden opgezogen. Dit resulteert in een natte celpellet. Haal het beschermkapje van de spuit, steek de zuiger en druppelen de cellen direct in een grote plastic beker gevuld met LN 2, gehouden in een LN 2 bad in een piepschuim doos. Geweld dompelen de overige cellen van de injectiespuit. Breng de ingevroren cellen om 50 ml buizen door gieten. Losjes cap de buizen, zodat overtollig LN 2 verdampen; Houd tzoom 's nachts bij -80 ° C. Draai caps volledig de volgende dag. De ingevroren cellen worden op deze manier opgeslagen bij -80 ° C tot cryomilling. LET OP: niet strak de buizen te sluiten voordat alle LN 2 zichtbaar is verdampt, anders overmatige druk kan ertoe leiden dat de buis om te ontploffen. Sluit niet de buizen na de LN 2 verdwenen is, kan de accumulatie van vorst op de cellen materiaal, toevoeging overtollige water gewicht en de eiwitconcentratie bij frezen effectieve vermindering. 2. Cryogene Verstoring van bevroren cellen LET OP: Alle gereedschappen voor het frezen en manipulaties moet vooraf worden gekoeld met LN 2. Een kleine decanter is vereist voor het toevoegen LN 2 in de pot en gieten LN 2 over de bovenkant van de gesloten frezen pot. Een zelfgemaakte tool wordt weergegeven in referentie 19. Cryogene handschoenen zal nodig zijn om omgaan met de LN 2 gekoelde maalinrichting. het frezenjar deksels die hier gebruikt (zie tabel van materialen) meestal geleverd met een rubberen afdichting geïnstalleerd; deze moet worden vervangen door een commercieel verkrijgbare Teflon deksel pakking het volgende protocol betrouwbaar uitvoeren. Bovendien, omdat de druk van gasvormige N2 kan opbouwen tot hoge niveaus binnen de pot tijdens het frezen, raden wij u aan een in de handel verkrijgbaar 5 bar / 500 kPa drukventiel als veiligheid vrijlating voorzorg 28. Verwijder cel kralen van -80 ° C opslag en houden in een 50 ml buis houder in een LN 2 badkamers. Pre-koelen van de 50 ml pot, twee 20 mm ballen, en het deksel in een schone rechthoekige ice emmer met LN 2. Pre-koelen polytetrafluorethyleen (PTFE) als via een isolator; ofwel een reeks pucks (zie referentie 27), of een huls-en-puck (zie figuur 2). Pre-koeling is voltooid wanneer de gewelddadige koken van LN 2 rust. Stel de juiste tegenwicht aan demolen. Opmerking: Dit is gelijk aan de massa van de pot, kruik zijn de maalkogels worden gebruikt en de hoeveelheid cellen worden toegevoegd aan de pot. Als een PTFE isolatoren worden gebruikt, moeten hun massa ook worden opgenomen. Wij stellen voor het opnemen van de massa's van de pot, deksel, en ballen (en hun totale massa, met inbegrip van alle isolator gebruikt) van tevoren en ze te registreren op een informatief blad opgeslagen in de buurt van de molen. Met behulp van een tang, plaatst u de twee pre-gekoelde 20 mm frezen ballen en de bevroren cellen in de pre-gekoelde frezen pot. Opmerking: Als gevolg van kleine verliezen van materiaal op de pot en bal oppervlakken bij het frezen, het percentage teruggewonnen materiaal toeneemt als celmassa gemalen toeneemt. Door de beschreven methode, materiële verliezen zijn zeer bescheiden, die in de orde van ~ 0,3 g natte cel gewicht (WCW). richtlijnen van de fabrikant geven de maximale volume van het monster geladen moet worden ~ 1/3 van de pot volume. 29 Het totale volume van de kogels dient ~ 1/3 en remaining ~ 03/01 vrije ruimte is voor het vrij verkeer van de ballen. LN 2 toe te voegen aan de pot tot ~ ½ vol, leg het deksel op de pot en breng het geheel aan de molen. LET OP: Installeer eerst de gekozen isolator bij gebruik van één. Klem de montage op zijn plaats en het uitvoeren van drie cycli van frezen met behulp van volgende programma: 400 rpm, 3 min, reverse-rotatie per minuut, geen pauze pauze. Koel het frezen pot met LN 2 tussen elke cyclus. LET OP: Tijdens het frezen van een duidelijke clunking geluid wordt geproduceerd als de ballen botsen binnen de pot in planetaire beweging. Als deze geluiden niet te horen zijn, is frezen niet plaatsvindt. Beëindigen freescyclus, hoeft deze cyclus niet mee, zet de pot assemblage terug naar LN 2 en onderzoekt de inhoud van de pot. Verzekeren geen ijs heeft gevormd en zo ja, chip deze van de pot muren met een voorgekoelde spatel. Begin opnieuw vanaf stap 2.5. Als gebruiken, wordt geen isolatie of isolator pucks, zet de pot assemblage terug naar LN <sub> 2 tussen de cycli opnieuw koel en voeg LN 2 tot ~ ½ full elke keer. De LN 2 toegevoegd zal verdampen in de pot als de temperatuur van de pot stijgt tijdens het frezen. Dit leidt tot drukopbouw in de pot. Daarom, wanneer het ontkoppelen van de pot van de molen, laat de klem heel langzaam. Als de klem snel wordt vrijgegeven, kan cel poeder ontsnappen met een snelle drukverlaging. Een langzame afgifte van de klem kan de druk kan ontsnappen uit de pot op een aangename en gecontroleerde wijze, en voorkomt dat celmateriaal. De zachte ontsnapping van gasvormige N2 kunnen vaak te horen sissen als de klem langzaam vrijkomt – dit is normaal. Bij gebruik van een huls-en-puck isolator, kan de pot assemblage worden achtergelaten in de molen en LN 2 toegevoegd aan de isolator / jar montage in situ. Beweeg de pot terug naar LN 2, en laat rusten even af te koelen. Bij gebruik van een huls-en-puck isolator kan de pot worden verwijderd uit de huls wet de hulp van twee spatels, bieden van een hefboomeffect aan beide zijden. Zodra de pot rust in LN 2, verwijder voorzichtig de deksel, verwijder de ballen met behulp van pincet, en breng het poeder aan een voorgekoelde 50 ml buis met een voorgekoelde spatel. Het toevoegen van een beetje LN 2 aan de open pot / poeder kan helpen om los poeder dat aangekoekt op de ballen, alvorens ze te verwijderen. Opmerking: wanneer de pot geopend, voeg een kleine hoeveelheid LN 2 te verwijderen voordat de ballen. Dit zal helpen om poeder aangekoekt op de oppervlakken te herstellen. Celpoeder moet worden gehouden bij -80 ° C of lager tot gebruik. In onze ervaring, kan de cel poeder worden opgeslagen op deze manier, in wezen voor onbepaalde tijd, zonder dat de prestaties. 3. Affiniteit Capture van eiwitcomplexen uit Cell Extracten Opmerking: Het volgende protocol implementeert affiniteitsmedia omvat een affiniteitsligand, aas of antilichaam dat een interactie met het eiwit van interesse, coupled om micron-schaal paramagnetische kralen. Deze kunnen worden bereid in-house 19,30, met behulp van in de handel verkrijgbare kits, of gekocht als kant-en-klare reagentia. Cell Extract Voorbereiding LET OP: Bij het hanteren van de cel poeder, vergeet niet om gebruiksvoorwerpen en buizen pre-gekoeld met LN 2 gebruiken. Buisjes die de cellen poeder moet altijd LN 2 worden gehouden wanneer deze niet op -80 ° C. Plaats de tube 50 ml (s) die cel poeder in een buis rek, in een piepschuim container met LN 2. Weeg 100 mg poeder cel in een 1,5 of 2 ml microfugebuis. LET OP: Wij hebben waargenomen dat deze hoeveelheid van de cellen is een goed uitgangspunt, dat doorgaans het doelwit eiwit zal op in de tientallen tot honderden nanogram variëren na affiniteitsinvangmiddel voor een matig tot expressie gebracht eiwit (~ 50 kDa massa aanwezig bij duizenden exemplaren per cel), vermoeden de winning en capture efficiency van het doel zijn ≳70%. Dergelijke opbrengsten zorgen voor directe visualizatie van de gezuiverde fractie door SDS-PAGE en eiwitkleuring. Tare analytische balans met de lege microfugebuis. Doseer cel poeder in een buis met behulp van een LN 2 gekoeld lepel of spatel. Controleer de massa van het poeder afgegeven binnen buis op de analytische balans. LET OP: Voor het gemak van de weging van de cel poeders, kunnen kleine volumetrische metende lepels worden gebruikt. Deze bleken reproduceerbare resultaten opleveren (zie referentie 19). We hebben de beste resultaten met behulp van schroefdop of "safe-lock 'microcentrifugebuizen gevonden. Druk verdampt LN 2 dat de buizen kan toegang kan veroorzaken standaard microcentrifuge buizen openspringen bij latere opwarming vlak voor de toevoeging van de extractieoplossing – kunnen leiden tot verlies van het monster. Open de tube (of losser schroefdop) met mobiele poeder en laat het staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Dit heft de druk binnen de buis en voorkomen dat de onmiddellijke bevriezing van de extractieoplossing wanneer toegevoegd aan het poeder. Geen ontdooiing wordt waargenomen tijdens deze 1 min incubatie. Voeg 400 ul van extractiemiddel aangevuld met proteaseremmers en vortex kort, houd dan op het ijs, terwijl u doorgaat met stap 3.1.5. De monsters moeten op ijs worden gehouden tussen alle volgende manipulaties tot elutie. OPMERKING: De beste samenstelling van het extractiemiddel zal afhangen van het eiwitcomplex (s) te zuiveren. Enkele algemene richtlijnen worden gegeven in tabel 1 en de ondersteunende gevonden. Gebruik een micropunt ultrasonicator aan het monster een korte lage energie puls aan een aggregaten uiteen te geven. (Ultra) ultrasone trillingen met 4 pulsen (2 sec per stuk, 2 A, circa 15-20 J van de totale energie). OPMERKING: vortexen verdeelt de cel poeder in het extractiemiddel, maar afhankelijk van de aard oplossing kunnen sommige aggregaten waargenomen. We hebben gevonden dat deze aggregaten te dispergeren voorziet in de beste opbrengst in latere affiniteitsinvangmiddel. Een korte micropunt Sonicatie verspreidt gemakkelijk deze aggregaten. De oplossing zou moeten verschijnen semi-doorzichtig, maar homogeen, zonder duidelijke aggregaten. Waterbad sonicators vaak te laag vermogen om dergelijke aggregaten efficiënt dispergeren zonder significant langere tijden monsterbehandeling, maar kan geschikt met juiste instellingen zijn. Verduidelijken het extract door centrifugeren (bijvoorbeeld 20.000 x g, 10 min, 4 ° C). Opmerking: Een portie van het geklaarde celextract kan worden opgeslagen ter vergelijking met de inhoud van de pellet, de post-affiniteitsinvangmiddel supernatant en de verkregen na elutie uit het affiniteitsmedium fracties om de efficiëntie van de extractie en vastleggen van het doeleiwit bepalen , bijvoorbeeld door western blot (zie Discussie). Verwijder de bovenstaande vloeistof (geklaarde extract) en ga verder met de affiniteit capture. OPMERKING: De pellet kan opnieuw geëxtraheerd in SDS-PAGE laadbuffer monster bij 70 ° C om de mate van afgifte van het doeleiwit d bepalenijdens de initiële niet-denaturerende extractie vergelijking met het extract verkregen in stap 3.1.6. affiniteit Capture Voorwas het magnetische affiniteit medium. Dit kan tijdens celextracten worden gecentrifugeerd. Plaats de buis (buizen) op de magneet. De kralen ophopen aan de zijde van de buis binnen enkele seconden, waardoor de opslagoplossing te verwijderen. Voeg 500 ul extractievloeistof aan korrels. Kort vortex mix met gemiddelde snelheid (voldoende om mengen). Pulse-draai de buizen in een mini-centrifuge om alle inhoud naar de bodem te verzamelen. Dit doet, zorgt voor de minimale overdracht van oplossingen. Plaats buizen op de magneet en zuig de oplossing. OPMERKING: magnetische media met onderscheidende eigenschappen zijn verkrijgbaar bij diverse commerciële leveranciers. De resultaten kunnen variëren afhankelijk van deze kenmerken, inclusief korrelgrootte, uniformiteit, coating en antilichaam koppelingschemie. Side-by-side trials in uw toepassing worden aanbevolen voor de afwikkeling op een keuze reagens. Start de affiniteitsinvangmiddel door de overdracht van de geklaarde celextract een 1,5-2,0 ml buisje met pre-gewassen affiniteit medium en vortex kort mengen. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C onder voortdurend voorzichtig mengen op een rotator wiel; de kralen moet in de hele incubatie blijven hangen. Pulse-draaien de buizen in een mini-centrifuge om alle inhoud te verzamelen op de bodem van de buis. Zuig het supernatant en was de kralen drie maal met 1 ml koude extractie als beschreven in stap 3.2.3. Plaats de buizen op de magneet. Verwijder de oplossing. Ga verder met de volgende oplossing toe te voegen en te herhalen. Tijdens de 2 e wassen, overdracht van de kralen en wasoplossing samen om een nieuwe microfugebuis door pipetteren. Dit vermindert monsterverontreiniging, op het punt van elutie, door willekeurige eiwitten geadsorbeerd aan de wanden van de buis voor incubatie met tHij celextract. Na de 3e wassen moet de kralen-puls kort gewerveld in een mini-centrifuge om alle inhoud naar de bodem te verzamelen. Plaats de buis terug op de magneet, en verwijder eventueel resterende vloeistof. Dit maakt het verwijderen van de laatste paar ul van de oplossing voor het elueren, zodat de geëlueerde monsters uniform volumes. Het zorgt ook elutie zal effectief zijn, aangezien de elutieoplossing wordt afgezwakt door resten van het wassen; deze residuen kunnen ook bijdragen aan zout effecten en de migratie van proteïnen in SDS-PAGE veranderen (zie hieronder). Opmerking: Een portie van het achteraf bindende supernatans worden opgeslagen ter vergelijking met het geklaarde extract gegenereerd 3.1.6. door western blot. Het resultaat zal de mate van uitputting van het doeleiwit uit het celextract geven. Elueer in ofwel een natieve of denaturerende manier; rekening houden met de strategie beste voor de downstream toepassing 1. LET OP: De details van inheemse elutie strategies hangt af van de affiniteit tag gebruikt (zie discussie). Voor de meeste gebruikers denaturerende elutie met SDS-PAGE monsterbuffer, gevolgd door analyse van het monster door SDS-PAGE met eiwitkleuring 31, de meest praktische eerste benadering. OPMERKING: De samenstelling van het monster buffer zal afhangen van de elektroforese-systeem wordt gebruikt. Veel labs wierpen hun eigen Tris-glycine gels, gebruik makend van discontinue elektroforese en het Laemmli buffersysteem 32-34. Een gemeenschappelijk monsterbuffer recept (1x) omvat: 10% (w / v) sucrose, 50 mM DTT, 2% (w / v) SDS, 62,5 mM Tris-Cl pH 8,8, 0,0004% (w / v) broomfenolblauw 31 . Wij stellen voor de voorbereiding van een 1.1x voorraad die DTT weglaat. 1/10 volume van 500 mM DTT aan het monster worden toegevoegd vóór SDS-PAGE (zie hieronder). Veel commercieel verkrijgbaar SDS-PAGE Eveneens beschikbaar; deze kunnen systeem-specifieke sample buffers. Voeg SDS-PAGE monsterbuffer zonder reducerend middel (om de vrijlating te verzachtenvan antilichaamketens van de bolletjes) en incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur onder schudden. LET OP: Dit zal interfereren met de meeste affiniteit gebaseerde interacties, het vrijgeven van de gevangen eiwitten in het supernatant. Meer aanhoudende interacties kunnen profiteren van de verhoogde temperatuur voor een release (typisch 70 ° C is voldoende). Verzamelen en opslaan van de bovenstaande vloeistof. Monsters kunnen worden ingevroren bij -20 ° C gedurende korte opslag (enkele dagen) of -80 ° C voor langere opslag tot analyse gewenst. Het aldus monsters aan SDS-PAGE gevolgd door eiwitkleuring via 31 standaardtechnieken. MS kan worden gebruikt om het vloeistofmonster 1 te karakteriseren. Afzonderlijke eiwitbanden worden uitgesneden voor identificatie of het gehele monster kan worden gekenmerkt, één analyse door elektroforese het monster slechts kort (4-6 mm in de gel) en het verwerken van alle proteïnen in het monster samen als een "gel plug. ' LET OP: Voeg DTT vóór InitiaTing elektroforese. Als u van plan om door te gaan naar MS, kunnen monsters gealkyleerd na elektroforese 35 zijn; echter is het vaak handiger om alkylaat voorafgaand aan elektroforese 36.

Representative Results

Figuur 1, paneel I illustreert dat cryomilling en magnetische korrels kunnen samenwerken om het monster te verbeteren. Panelen IA-C tonen dat het materiaal dat de onoplosbare drager voor de affiniteitsinvangmiddel de teruggewonnen proteoom 19 kunnen beïnvloeden. Het eiwit van interesse, gezuiverde FLAG-tag bacteriële alkalische fosfatase (BAP), werden bijgevoegd in humane celextracten. BAP wordt niet verwacht dat specifiek interactie met en copurify menselijke eiwitten. De handtekening van copurifying eiwitten, beoordeeld door SDS-PAGE en Coomassie kleuring, gevarieerd afhankelijk van het gebruikte medium. Micronschaal magnetische korrels toonde de schoonste profiel wijst op een relatief laag niveau van niet-specifieke adsorptie eiwit. Panelen ID en IE tonen, dat de werkwijze cellysis ook de opstelling kan de teruggewonnen proteoom. In de verstrekte voorbeeld, een endogeen eiwit complex (de NEXT complex 37), werd onderworpen aan affiniteit capture van cyromilled of ultrageluid behandeld celextracten 19. Minder hoogmis verontreinigingen werden waargenomen wanneer de cel extract werd geproduceerd uit cryomilled cel poeder. Een probleem bij het gebruik affiniteitsinvangmiddel endogeen eiwitcomplexen studie is dat het moeilijk bonafide fysiologische interactors van het eiwit van interesse van valse positieven (KP) onderscheiden zijn. KP kan ontstaan ​​uit vele bronnen, waaronder niet-specifieke adsorptie buizen en vaten, het affiniteitsmedium, het antilichaam of ligand affiniteit, en / of het eiwit van belang zelf. Als gevolg daarvan moeten grote inspanningen worden besteed aan het optimaliseren van het capture proces. De detectie van KP's blijft een centrale uitdaging waarvoor een groot aantal verschillende instrumenten ontwikkeld, met inbegrip van experimentele 38-40 en computationele benaderingen 41-43, elk met verschillende voor- en nadelen. In onze eigen experimenten we eerder opgemerkt een patroon van FP proteïnebinding, verkregen na incubatie van α-FLAG magnetisch medium met controle celextracten, die verschilde van de verkregen in de aanwezigheid van 3xFLAG-gemerkte eiwitten patroon. Bovendien kunnen deze KP uit het medium vrijgegeven door incubatie met peptide 7 3xFLAG. Deze waarneming is consistent met opportunistische binding van KP de α-FLAG paratoop in afwezigheid van de verwante epitoop. Inzicht in de aard van de FP achtergrond is belangrijk omdat veel studies maken gebruik van een niet-gecodeerde "ouderlijke cellijn 'als een mock controle voor affiniteitsinvangmiddel; deze controles kan daarom ongeschikt om de specificiteit van interacties met de tag eiwit te bepalen. Als achtergrondbepaling binding bijgedragen door onze affiniteitsmedium wanneer paratopen antilichaam bezet zijn of niet, voerden we mock affiniteitsinvangmiddel experimenten met α-FLAG magnetische drager en HEK 293T celextracten (geen gemerkt eiwit tot expressie gebracht) in de aanwezigheid of afwezigheid van een 3xFLAGpeptide spike-in. De resultaten worden getoond in Figuur 1, paneel II. In het kort werd α-FLAG magnetisch medium geïncubeerd in celextracten (of ≳10 mg / ml totaal eiwit) bevattende 500 mM NaCl en 1% v / v Triton X-100 in 20 mM HEPES-Na pH 7,4 gedurende 30 minuten. Het medium werd vervolgens geïncubeerd met 1 mg / ml 3xFLAG peptide aan een eiwit gebonden aan de α-FLAG paratoop native of SDS-PAGE monsterbuffer om een ​​denaturerend elutie bereiken concurrerend verplaatsen. Daarnaast werd hetzelfde experiment uitgevoerd, wanneer de celextracten werden ingespoten met 1 ug / ml en 10 ug / ml peptide 3xFLAG. Alle geëlueerde fracties werden onderworpen aan SDS-PAGE en zilverkleuring. We vonden dat bij afwezigheid van zijn verwante epitoop, α-FLAG medium heeft een detecteerbare hoeveelheid achtergrond eiwitten die kunnen worden geëlueerd met 3xFLAG peptide vastleggen – in de door figuur 1-II voorbeeld, werd een dominante species waargenomen bij tussen 37 en 50 kDa. Het patroon geëlueerd metSDS-PAGE monsterbuffer was vergelijkbaar met andere prominente soorten. Echter, in de aanwezigheid van 1 ug / ml peptide 3xFLAG FP binding aan het affiniteitsmedium is geëlimineerd onder het detectieniveau en werd niet waargenomen in ofwel de natieve of denaturerende elutiefracties. Dit resultaat suggereert dat onbezet antilichaam paratopen promiscue in afwezigheid van hun verwante epitoop kunnen zijn en aanzienlijk bijdragen aan het proteoom verkregen bij affiniteitsinvangmiddel zelfs antilichamen die de epitoop met hoge affiniteit te binden, zoals het geval is voor de 3xFLAG / α-FLAG M2 pairing. Het suggestd dat zeer stringente omstandigheden met gebruikmaking hoog zoutgehalte, vaak gekozen om niet-specifieke binding te beperken, ineffectief bij afwezigheid van het antigeen / antilichaam interactie kan zijn. Follow-up we een soortgelijk experiment zoals een analyse met SDS-PAGE en kwantitatieve MS (Fig. S1) uitgevoerd. Van de 347 eiwitten gekwantificeerd, we hebben geconstateerd dat elk eiwit te sparen voor een (valse discozeer rate = 1%; Tabel S1) leidde tot de 3xFLAG gemerkte bait eiwit in vergelijking met een 3xFLAG peptide spiked controlemonster. Deze resultaten geven aan dat in onze experimenten de overgrote meerderheid van eiwitten waargenomen waarschijnlijk tezamen worden gezuiverd met het gemerkte eiwit of off-target bijproducten onbezette α-FLAG paratopen. In onze ervaring, zijn hoge signaal-ruis affiniteitsinvangmiddel resultaten toegelicht in SDS-PAGE en eiwit kleuring door een discrete patroon van scherpe, overvloedige en grofweg stoichiometrische bands, evenals een gebrek aan achtergrond kleuring van andere zwakker bands; talrijke voorbeeld van dit principe kan worden gezien in referentie 11. De reden voor het gebruiken van een PTFE isolator (die wordt aanbevolen) wanneer cryomilling is om de snelheid van opwarming van de pot te verminderen tijdens het malen, de last van herhaalde LN 2 koeling verminderen tijdens het maalproces en het verminderen van de mate van ijsformatie in de pot. Dit vergemakkelijkt consistente freesprestaties en vergemakkelijkt het hanteren van de celpoeder. Voorbeeld isolatoren kan gevonden worden in referentie 27 (pucks) en weergegeven in figuur 2, hieronder (sleeve-and-puck). Figuur 1: Selecteer Representatieve resultaten. (I) Dit panel is gewijzigd uit referentie 19. Coomassie Blauw gekleurde SDS-polyacrylamidegel. (LINKS) Micron-schaal magnetische korrels tonen lagere off-target binden dan agarose gebaseerde media. (A) magnetische korrels; (B) de traditionele agarose; (C) ijzer geïmpregneerd (magnetische) agarose; elk gekoppeld met anti-FLAG M2 antilichamen en gebruikt om FLAG gemerkte bacteriële alkalische fosfatase vangen (BAP, gelabelde) ingespoten in uittreksels uit cryomilled HEK-293-cellen. Agarose gebaseerde zuiveringenvertoonden hogere niveaus van niet-specifieke adsorptie (ongelabeld groepen). (Rechts) Uittreksels geproduceerd uit cryomilled HeLa-cellen vertonen een lagere off-target adsorptie upon-antilichaam gekoppeld magnetische korrels zijn dan die geproduceerd door sonicatie wanneer gebruikt om een ​​endogeen eiwitcomplex te zuiveren. -LAP tag 44 RBM7 werd affiniteit vastgelegd met behulp van magnetische bolletjes gekoppeld aan polyklonaal anti-GFP antilichamen tegen het NEXT complex 19,37 (D) te zuiveren extract dat wordt gevormd uit cryomilled poeder; (E) extracten geproduceerd door sonicatie van intacte cellen. De verticale zwarte balk wijst op een gebied van de gel waar hoge massa aspecifieke interactoren waargenomen worden verrijkt in het monster bereid door sonicatie. De zwarte pijlen aangegeven de verwachte specifieke interactoren (label). Banden waargenomen ~ 50 kDa in lanen D en E worden toegerekend aan lama IgG zware ketens. (II) Silver gekleurde SDS-polyacrylamidegel. (Std.) Een mock affiniteitsinvangmiddel uitgevoerd op HEK-293T-cel-extracten in de standaard manier. Na het vangen, werd elutie van het gebonden materiaal bereikt door (N) niet-denaturerende elutie met 1 mg / ml 3xFLAG peptide of (D) denaturering elutie in SDS-PAGE monsterbuffer; (PB 1) als Std. maar de 3xFLAG peptide werd opgenomen in de extractieoplossing bij 1 ug / ml aan de α-FLAG paratopen op het affiniteitsmedium blokkeren; (PB 10) PB 1, maar in de aanwezigheid van 10 ug / ml peptide 3xFLAG. IgG-gerelateerde bands en 3xFLAG peptide zijn gelabeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Sleeve-and-puck PTFE isolator. Een 250 ml PTFE pot wordt weergegeven (1). Een 50 ml roestvrijstalen frezen jar (2) past in de PTFE pot (3) en degelegenheid om de frezen pot binnen de molen tussen de cycli geïnstalleerd vertrekken. Een bovenste PTFE isolator puck (2) wordt gebruikt tussen de klem montage en de pot deksel. De geïnstalleerde pot en isolatie samenstel (3) te koelen, wordt LN 2 direct toegevoegd aan het lichaam van de isolator rond de pot. De volgende cyclus bewerkingsstadium kan vervolgens worden geïnitieerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Reagens gesuggereerd Concentratie Notes natriumchloride 0,1-0,5 M Hoge concentraties (> 300 mM) hebben de neiging om de extractie van totaal eiwit te verbeteren en houden achtergrond laag, maar kan ontdoen van een aantal anders stabiele interactoren. Concentraties onder 150 mM zijn meestal niet effectief in het verminderen van niet-specifieke achtergrond. ammoniumacetaat 0,2-2 M Een zout, dat bestaat uit twee buffers, dat een neutrale pH oplossing 57 oplevert. Hogere concentraties te stabiliseren enkele eiwitcomplexen. Zure oplossingen kan het gevolg zijn van oude, niet goed opgeslagen kristallijne voorraden als gevolg van ammoniak verlies. Geen extra pH buffer of zouten vereist extractiemiddelen met ammoniumacetaat. Kan worden gecombineerd met NaCl tot resultaten te moduleren. Tween 20 0,1% v / v Een niet-ionisch detergens 58; meestal gecombineerd met NaCl. Triton X-100 0,5-1% v / v Een niet-ionisch detergens 58; meestal gecombineerd met ofwel NaCl of NH 4 CH 3 CO 2 H CHAPS 5 mM Een zwitterionische wasmiddel 58 </ Sup>; meestal gecombineerd met NaCl. Sarkosyl 1 mM Een anionisch detergent 58 die achtergrond vermindert en kan ontdoen stabiel complexe componenten, potentieel onthullen binaire connectiviteit; meestal gecombineerd met NaCl. Tris-Cl 20 mM pKa van 8,8 bij 4 ° C, 8,1 bij 25 ° C. (PH 8,0) HEPES-Na 20 mM pKa van 7,8 bij 4 ° C, 7,5 bij 25 ° C. NaOH of KOH voor pH equilibratie afhankelijk van het zout (bijvoorbeeld NaCl, KCl of CH 3 CO 2 K) die in het extractiemiddel. (PH 7,4) Tabel 1: enkele voorgestelde reagentia bruikbaar voor het zuiveren van eiwitcomplexen. Deze tabel listen sommige reagentia we hebben die bruikbaar zijn voor het zuiveren van eiwitcomplexen uit humane cellijnen gevonden, met voorgestelde werken concentraties. Een typische formulering extractiemiddel een pH-buffer, een zout en een detergens 1,11,24,45-48. Best practice is om de minst complexe combinatie van reagentia die het gewenste resultaat oplevert identificeren. Figuur S1: Meng na zuivering (MAP) SILAC analyse van valse positieven. I. Schematisch diagram: In dit experiment 3xFLAG gemerkt ORF2p eiwitcomplexen (expressie van pLD401) werden gezuiverd uit zware en lichte gemerkte HEK-293T cellen 7, respectievelijk. Het licht gelabelde cel extract werd verrijkt met 3xFLAG peptide aan affiniteit vangst van de 3xFLAG-getagde ORF2p door competitieve remming te voorkomen; Dit wordt niet verwacht dat de binding van eiwitten die niet-specifi optreden blokkerengrammen op het magnetische medium of de niet-paratopic structuren van het antilichaam. Na elutie uit de magnetische korrels, de zware en lichte monsters werden gemengd na zuivering en geanalyseerd door kwantitatieve MS (MAP-SILAC 39) om de fractie van eiwitten tezamen met monster te bepalen; verdere methodologische detail in Tabel S1. II. Zilver gekleurde gel die illustreert dat de lichte en zware gelabelde materialen leveren vergelijkbare resultaten (vergelijk met l H), en dat de zuivering in aanwezigheid van de 3xFLAG spike-in (LI) was competitief geremd. Hieronder wordt een Coomassie Blue G-250 gekleurde gel plug bestaat uit de gemengde H en LI fracties vóór gel gebaseerde proteoomanalyse, zoals beschreven in Tabel S1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te downloaden. Tabel S1:MAP-SILAC. Dit blad bevat de verkregen na uitvoering van de MAP-SILAC experiment in figuur S1 beschreven gegevens. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Deze drie protocollen worden gecombineerd om (1) te bereiden cellen voor solid-state breuk door cryomilling, (2) bereiken breuk in een planetaire kogelmolen en (3) te produceren extracten van cel poeder affiniteitsinvangmiddel een eiwit van belang in complex met zijn fysiologische interactors. Vele verschillende technieken bestaan cellysis inclusief mechanische / fysische benaderingen gebruik breken effect, scheren en / of druk en chemische / enzymatische benaderingen, elk met verschillende voor- en nadelen 49,50. Elke onderzoeker wordt aangemoedigd om methoden het meest geschikt zijn voor hun analyses te verkennen, in gedachten houden dat elke gekozen aanpak voor mobiele breuk en eiwit extractie is waarschijnlijk vooroordelen 51,52 noodzakelijk empirische optimalisatie (hieronder besproken) te introduceren. Mechanische werkwijzen kunnen hoge temperaturen en / of schuifkrachten die eiwitcomplexen kunnen verstoren produceren. Cryomilling voorkomt verwarming effecten uit hoofde van het gebruik van LN 2 koeling van monsters voor thij duur van het proces. Planetaire kogelmolens worden verstaan vertrouwen op impact en wrijvingskrachten, waaronder afschuifspanning als bestanddelen van deeltjesgrootteverkleining 53,54. Bij de instellingen gemeld hebben we niet waargenomen degeneratie van eiwitcomplexen. Inderdaad hebben we gewonnen en haalde blijkbaar intact ~ 50 MDa nucleaire porie complexen 11 en enzymatisch actief retrotransposons vertonen hogere specifieke activiteit dan de voorbereidingen in dienst 'zachte' detergent-gebaseerde lysis 7. Chemisch / enzymatische werkwijzen cellysis lijden aan de beperking dat de inhoud van de cel vrij in een in vitro milieu dat de verstoring van celmembranen en structurele macromoleculen ondersteunt maar kan niet geschikt zijn voor handhaving van de integriteit van het eiwit complex (es ) van belang. Vaak, noch de bestanddelen van de complexen gevormd met het eiwit van belang of de omstandigheden die nodig zijn om het doel te stabiliseren complexentevoren bekend. Een groot voordeel van solid-state frezen die breuk en extractie ontkoppeld, waardoor uitgangsmateriaal vrij van toegevoegde vloeistof te bereiden, bewaard (bij -80 ° C of lager), vergaard en gemakkelijk opgehaald voor on-demand experimenten; bijvoorbeeld, om te verkennen geoptimaliseerd in vitro voorwaarden voor affiniteitsinvangmiddel. Eiwit interacties zijn het meest stabiel bij hoge concentratie 55,56, dus het minimaliseren van de hoeveelheid extractiemiddel kan voordelig voor het bewaren fysiologische interacties. Aan de andere kant zijn er praktische overwegingen – de eiwitcomplexen hoeft uit de cellen en in een niet-viskeuze waterfase, vrij van onoplosbare aggregaten worden verdeeld, zodat het doel complexen met het affiniteitsmedium mengen. Bovendien is enige standaardisatie en controle via in vitro milieu (pH, zoutconcentratie, enz.) Nodig voor systematisering en reproduceerbaarheid. We vinden dat pr-extractenoduced in de verdunning van 1: 4-1: 9 (w: v) voldoen praktische en theoretische problemen, waarbij kwaliteitsresultaten. Bovendien is de optimale verhouding van celextract tot gemiddelde behoefte affiniteit te bepalen. Dit wordt empirisch uitgevoerd door titratie van fragmenten met variërende hoeveelheden affiniteitsmedium en kan detecteerbaar effect hebben op de signaal-ruisverhouding van de proef verder besproken. Een uitstekende depletie van het doeleiwit typisch ≥70% van de oplosbare fractie van het doeleiwit, maar> 90% is wenselijk en kan worden bereikt met zorgvuldige parametrering van extractie omstandigheden. Veel van dergelijke praktische overwegingen zijn opgenomen in referentie 1. Paramagnetische kralen worden gemanipuleerd met behulp van neodymium magneten in een gespecialiseerde microcentrifugebuis houder, hoewel zelfgemaakte alternatieven levensvatbaar zijn. Bij plaatsing in de houder, korrels verzamelen aan de zijkant van de buis onder invloed van het magnetische veld. Oplossingen kunnen dan worden verwijderd zonder disturbing de kralen.

Een beperking van de gepresenteerde cryomilling protocol, ontwikkeld met de planetaire kogelmolen hier gebruikt (zie tabel of Materials), dat een minimale hoeveelheid materiaal nodig om effectief molen en herstellen celpoeder gebruik van dit apparaat (> 1 g). Dergelijke hoeveelheden kunnen gemakkelijk verkregen met veel microben, cellijnen en modelorganismen, en kunnen vaak worden bereikt met weefsel uitgesneden uit proefdieren. Echter, kunnen bepaalde cellijnen zeer moeilijk om te groeien in overvloed en dierlijke weefsels kunnen schaars zijn. Kleinere hoeveelheden materiaal kan vergelijkbare gemalen worden met behulp van andere apparaten gebruik te maken van kleinere containers, hoewel potentieel ten koste van het poeder fijnheid bereikt. Bovendien kunnen de kosten van mechanische freesinstallaties onbetaalbaar voor sommige laboratoria. Cryomilling kan worden bereikt met een aantal alternatieve opstellingen 14-19, waarvan de meest betaalbaar handmatig met een plaagle en mortel, hoewel breuk efficiency aanzienlijk daalt. Affiniteitsinvangmiddel standaard wordt gestreefd naar een hoge efficiëntie van cellysis om maximale extractie eiwit in oplossing en dus maximale mogelijkheden voor het vangen van het doeleiwit complexen vergemakkelijken. Anderzijds, is aangetoond voor gist in vitro splicing extracten die maximale lysis niet gelijk kunnen stellen met maximale in vitro biochemische activiteit 57,58. Er is waargenomen dergelijke problemen in de systemen die we tot nu toe getest en derhalve niet doelbewust onze celbreuk beperken bij cryomilling. Toch moet deze mogelijkheid rekening mee worden gehouden bij het optimaliseren van in vitro enzymatische assays. Hoewel cryomilling is een zeer effectieve methode voor het breken van cellen, een beperkte sonificatie vaak voordelen de productie homogeen volledige celextracten van zoogdierweefsels vanwege inhomogene aggregaten soms worden waargenomen door visuele inspectie: typischin extractiecondities gebruik van lage tot matige zout (100-300 mM) en niet-ionische detergens (0,1-1% v / v) concentraties. Omdat we waargenomen dat de aanwezigheid van deze aggregaten de opbrengst en / of kwaliteit van de daaropvolgende affiniteitsinvangmiddel kunnen verminderen, we routinematig uitvoeren sonicatie ze dispergeren (zelfs wanneer ze niet worden waargenomen met het blote oog). De aggregaten zijn consistent met geagglomereerd membraanfragmenten, vergelijkbaar met die eerder gerapporteerd in extracten van gemalen 58 gistcellen. Sonicatie wordt ook gebruikt in sommige protocollen DNA afschuiving bevrijden chromatine fragmenten in oplossing, maar de mate van sonicatie toegepast in dit protocol niet merkbaar fragment DNA. De beperkte beschikbaarheid (of hoge kosten) van een uitstekende affiniteit ligand of antilichaam tegen het specifieke eiwit van interesse kan een beletsel zijn. Een breed scala aan commercieel verkrijgbare affiniteit reagentia kunnen worden ingezet wanneer de modelorganisme vatbaar is voor genoom tagging of transfection met ectopische expressie vectoren, die de expressie van de eiwitten van belang als affiniteit tag fusies. Echter, de productie van antilichamen aangepaste steeds haalbaar geworden en zowel polyklonale als monoklonale antilichamen kunnen uitstekend presteren in affiniteitsinvangmiddel toepassingen. Deze vele overwegingen komen ook aan bod in meer detail in referentie 1.

Voorbeelden van de cel lysis werkwijze en keuze van affiniteitsmedium resultaten kunnen beïnvloeden zijn aangegeven in figuur 1. Voorbeelden van effecten uitgeoefend door verschillende extractiemiddelen te zien in referenties 1,11,24. Omdat deze en andere experimentele parameters hebben invloed op de kwaliteit van de affiniteitsinvangmiddel, waardoor het moeilijk te onderscheiden KP, repositories van "bead eiwitprofielen" en Computerbenaderingen te elimineren niet-specifieke verontreinigingen ontwikkeld in dier KP 40-43. Toch dergelijke benaderingen alleen substitute voor een optimale monstervoorbereiding in beperkte mate 59. Inachtneming van de beste praktijken en empirisch optimaliseren van de affiniteitsinvangmiddel experiment zal de hoogste kwaliteit monsters voor downstream analyses, hieronder verder besproken. Een eenvoudig te implementeren praktijk die sample zuiverheid kunnen verbeteren is inheems elutie. Inheemse elutie wordt het meest gebruikt om de affiniteit geïsoleerde eiwitcomplex, intact, voor verdere experimenten te verkrijgen; maar zoals het vaak verbetert sample zuiverheid, het kan ook gebruikt worden om deze reden alleen. Zoals aangetoond in Figuur 1, paneel II, het vermogen van natief elutie monster zuiverheid verbeterd kan afhangen van een nauwkeurige titratie van de hoeveelheid affiniteitsmedium de overvloed aan het doeleiwit in het celextract – wanneer het medium boven , onbezette paratopen kan de off-target accumulatie van FP eiwitten waarneembaar in de native geëlueerde fracties mogelijk te maken. Gebruik van de reagentia en procedures hier beschreven, honze ervaring dat de enige grootste bijdrage van KP onze experimenten is de gelabelde eiwit zelf wanneer het van de context van de levende cel. (Fig. 1, deel II en fig. S1). In dat geval oudercellijn controles die irrelevant proteomen op in afwezigheid van het antigeen van geen praktische waarde; evenzo voor tag-only of spike-controles die verstoken zijn van iets anders dan het doelantigeen zijn. Daarom, wanneer we praktische uitvoering van I-VUIL 7,38, die direct meet de accumulatie van post-lysis eiwit interacties met behulp van kwantitatieve MS. Zoals vermeld in stap 3.2.7 van het protocol, zal de procedures voor inheemse elutie variëren met de details van de affiniteit systeem gebruikt. Inheemse elutie wordt meestal bereikt door competitieve verdringing van het gemerkte eiwit complex of proteolytische splitsing van het label, het vrijgeven van het complex van het affiniteitsmedium. Verschillende affiniteit systemen bestaan ​​uit kleine epitoopmerkers bestaan, for die het epitoop zijn niet beschikbaar als peptide bruikbaar zijn voor competitieve elutie gelabelde eiwitcomplexen 60. Ook verschillende proteasen zijn specifiek splitsen cognate sites in affiniteit strategisch geplaatste tagged fusieproteïnen 61. Afhankelijk van de specifieke kenmerken van de gekozen affiniteit-systemen, kan de juiste elutie regeling worden aangenomen.

In het algemeen zal de kwaliteit van de verkregen resultaten sterk worden beïnvloed door de kwaliteit van de monsterbereiding. Het is belangrijk om zorgvuldig en nauwkeurig werken bij elke stap van deze protocollen, en zo snel mogelijk met behoud zorgvuldigheid. Het is raadzaam om de verdeling van het eiwit van belang te volgen bij elke stap voor de efficiëntie van elke manipulatie begrijpen. Bijvoorbeeld: hoe overvloedig is het eiwit van belang in de cel of weefsel in kwestie? Misschien is het eiwit onder studie (en zijn complexen) zal een uitdaging te karakteriseren door de massaspectrometrie als gevolg van lage overvloed. Als de gezuiverde complexen worden gedetecteerd door de algemene eiwit kleuring (ongeveer nanogram range), massaspectrometrie een kans van slagen. Als de gevangen eiwit van belang alleen gevoelig verbeterde chemiluminescentie Western blotting (ongeveer picogram range) kan worden gedetecteerd, massaspectrometrie minder waarschijnlijk effectief zijn. Zelfs indien het gewenste eiwit is overvloedig aanwezig in de cel, hoe overvloedig is in het celextract geproduceerd? Is de partitie eiwit aan de oplossing of in de pellet? In het laatste geval kan een nieuwe extractie-oplossing worden bedacht dat herstel kan verbeteren. Zodra het celextract wordt gecombineerd met het affiniteitsmedium, hoe effectief het eiwit gevangen? Is het eiwit blijven gebonden door opeenvolgende wasbeurten? Hoe zit het met andere copurifying eiwitten? Door het opslaan van een hoeveelheid van elk monster op passende stappen van het protocol deze vragen gemakkelijk kunnen worden beantwoord, typisch door Western blotting tegen het eiwit van interesseof algemene eiwitkleuring, maar andere testen kunnen ook geschikt zijn. Optimaliseren elke stap zal de opbrengst en zuiverheid van de gevangen complexen te verbeteren, maar er kan een afweging worden gemaakt bij het maximaliseren van een kenmerk of de andere.

Een typische toepassing van affiniteitsinvangmiddel vele onderzoekers om kandidaat identificeren vivo interactors een klein aantal eiwitten van belang; deze kandidaten worden gewoonlijk onderworpen aan goedkeuring door orthogonale benaderingen in vivo de biologische betekenis van de fysieke interactoren tonen. Affiniteitsinvangmiddel wordt ook gebruikt door high-throughput studies om lijsten van copurifying eiwitten waargenomen op een (bijna) proteoom-brede basis, het vergemakkelijken van computational gevolgtrekkingen met betrekking tot vermeende in vivo complexen te genereren. Talrijke voorbeelden van dergelijke studies is te vinden in de literatuur. Deze benadering afziet optimalisering van de voorwaarden vast te leggen voor een bepaald doel in het voordeel van het verkennen van de mensy doelstellingen; als zodanig, de afgeleide complexen zelf zelden opgehaald volledig intact en zeer zuivere in een gegeven monster. Integendeel, de gedeeltelijke overlappingen op samenstellingen waargenomen tussen talrijke verschillende affiniteit opgevangen monsters worden gebruikt als basis voor de conclusies 42. Beide benaderingen bijdragen waardevolle gegevens aan ons begrip van de interactoom. Toch is een groot voordeel van affiniteitsinvangmiddel is dat het vaak bieden de mogelijkheid om de complexen intact en zeer gezuiverd, indien getracht wordt de procedure te optimaliseren verkrijgen. We geloven dat de toekomst van de aanpak is het vergroten van het gemak en de efficiëntie van het optimaliseren van de vangst van endogene eiwitcomplexen 11 om een nauwkeuriger beoordeling van het gamma van fysiologische interactorenen vaker gebruik stroomafwaarts biochemische, enzymologische en structurele studies, bijvoorbeeld, verwijst 7,9,23.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Professor Brian T. Chait voor zijn waardevol advies, ondersteuning en toegang tot MS instrumentatie, evenals mevrouw R. Kelly Molloy voor een uitstekende technische ondersteuning. Wij danken Ms. Kelly Bare voor ondersteuning met een kopie te bewerken. Dit werk werd mede ondersteund door NIH subsidies P41GM109824, P41GM103314 en P50GM107632.

Materials

Growth media & cell culturing implements For producing frozen cells (I)
500 cm^2 culture dishes Corning 431110 For producing frozen cells (I)
Large beaker (1-2L) For producing frozen cells (I)
Rectangular ice pan  Fisher Scientific  13-900-747 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
Phosphate buffered saline (PBS) For producing frozen cells (I)
Large cell scrapers Fisher Scientific  08-100-242 For producing frozen cells (I)
Liquid nitrogen  For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
50 ml conical tubes Corning 352098 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
20 ml Luer lock syringe For producing frozen cells (I)
Leur lock syringe caps www.dymax.com T11182 For producing frozen cells (I)
Refrigerated centrifuge For producing frozen cells (I)
50 ml tube rack, 4 position For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Styrofoam box For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Planetary ball mill, PM 100  Retsch 20.540.0001  For cryomilling (II)
Stainless steel milling jar, 50 ml  Retsch 01.462.0149 For cryomilling (II)
Stainless steel milling balls, 20 mm Ø  Retsch 05.368.0062 For cryomilling (II)
Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm   www.marcorubber.com T1044-2.62×44.63 For cryomilling (II)
mini-LN2 decanter homemade see Ref 19 For cryomilling (II)
250 ml PTFE jar insulator (optional) Retsch custom order For cryomilling (II)
PTFE puck insulator (optional) homemade The Rockefeller University For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.
5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional) http://www.leeimh.com/ 558 series check valve For cryomilling (II)
1.5 – 2 ml microfuge tubes For affinity capture (III)
Extractant For affinity capture (III)
cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets Roche Applied Science 11873580001 For affinity capture (III)
Vortex mixer For affinity capture (III)
Ice bucket For affinity capture (III)
Microtip sonicator, Q700 Qsonica Q700 For affinity capture (III)
low intensity 1/16” microtip probe Qsonica 4717 For affinity capture (III)
Bench-top refrigerated microcentrifuge For affinity capture (III)
Dynabeads M-270 Epoxy Thermo Fisher 14302D For affinity capture (III)
Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads homemade For affinity capture (III); see reference 19
Sample rotator  For affinity capture (III)
Neodymium magnet Life Technologies 123-21D  For affinity capture (III)
SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) For affinity capture (III)
DTT For affinity capture (III)
SDS-PAGE system For affinity capture (III)
SDS-polyacrylamide gel For affinity capture (III)
Protein Stain For affinity capture (III)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LaCava, J., Molloy, K. R., Taylor, M. S., Domanski, M., Chait, B. T., Rout, M. P. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: Pointers, pitfalls, preferences and perspectives. BioTechniques. 58 (3), 103-119 (2015).
  2. Devos, D., Russell, R. B. A more complete, complexed and structured interactome. Curr Opin Struct Biol. 17 (3), 370-377 (2007).
  3. Aitchison, J. D., Rout, M. P. The interactome challenge. J Cell Biol. 211 (4), 729-732 (2015).
  4. Nie, Y., Viola, C., et al. Getting a grip on complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
  5. Bonetta, L. Protein-protein interactions: Interactome under construction. Nature. 468 (7325), (2010).
  6. Perkel, J. M. Protein-Protein Interaction Technologies Toward a Human Interactome. Science. 329 (5990), 463-465 (2010).
  7. Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Affinity Proteomics Reveals Human Host Factors Implicated in Discrete Stages of LINE-1 Retrotransposition. Cell. 155 (5), 1034-1048 (2013).
  8. Liu, J. -. J., Bratkowski, M. A., Liu, X., Niu, C. -. Y., Ke, A., Wang, H. -. W. Visualization of distinct substrate-recruitment pathways in the yeast exosome by EM. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 95-102 (2014).
  9. Shi, Y., Pellarin, R., et al. A strategy for dissecting the architectures of native macromolecular assemblies. Nat Methods. 12 (12), 1135-1138 (2015).
  10. Roque, A. C. A., Lowe, C. R. Affinity chromatography: History, perspectives, limitations and prospects. Methods in Molecular Biology. 421 (1), 1-21 (2007).
  11. Hakhverdyan, Z., Domanski, M., et al. Rapid, optimized interactomic screening. Nat Methods. 12 (6), 553-560 (2015).
  12. Huttlin, E. L., Ting, L., et al. The BioPlex Network: A Systematic Exploration of the Human Interactome. Cell. 162 (2), 425-440 (2015).
  13. Hein, M. Y., Hubner, N. C., et al. A Human Interactome in Three Quantitative Dimensions Organized by Stoichiometries and Abundances. Cell. 163 (3), 712-723 (2015).
  14. Smucker, R. A., Pfister, R. M. Liquid nitrogen cryo-impacting: a new concept for cell disruption. Appl Microbiol. 30 (3), 445-449 (1975).
  15. Schultz, M. C., Choe, S. Y., Reeder, R. H. Specific initiation by RNA polymerase I in a whole-cell extract from yeast. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (3), 1004-1008 (1991).
  16. Schultz, M., Hockman, D., Harkness, T., Garinther, W., Altheim, B. Chromatin assembly in a yeast whole-cell extract. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (17), 9034-9039 (1997).
  17. Stevens, S. W., Abelson, J. Yeast pre-mRNA splicing: Methods, mechanisms, and machinery. Method Enzymol. 351, 200-220 (2002).
  18. Oeffinger, M., Wei, K. E., et al. Comprehensive analysis of diverse ribonucleoprotein complexes. Nat Methods. 4 (11), 951-956 (2007).
  19. Domanski, M., Molloy, K., et al. Improved methodology for the affinity isolation of human protein complexes expressed at near endogenous levels. BioTechniques. , 1-6 (2012).
  20. Sinclair, B. To bead or not to bead: Applications of magnetic bead technology. Scientist. , (1998).
  21. Cristea, I., Williams, R., Chait, B., Rout, M. Fluorescent proteins as proteomic probes. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 1933-1941 (2005).
  22. Di Virgilio, M., Callen, E., et al. Rif1 prevents resection of DNA breaks and promotes immunoglobulin class switching. Science. 339 (6120), 711-715 (2013).
  23. Heider, M. R., Gu, M., et al. Subunit connectivity, assembly determinants and architecture of the yeast exocyst complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (1), 59-66 (2016).
  24. LaCava, J., Fernandez-Martinez, J., Hakhverdyan, Z., Rout, M. P. Protein Complex Purification by Affinity Capture. Budding Yeast: A Laboratory Manual. 2016 (21), 383-397 (2016).
  25. Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells. , (2011).
  26. Uphoff, C. C., Drexler, H. G. . Basic Cell Culture Protocols. 946, (2013).
  27. Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Characterization of L1-Ribonucleoprotein Particles. Transposons and Retrotransposons. 1400 (Chapter 20), 311-338 (2016).
  28. Obado, S. O., Field, M. C., Chait, B. T., Rout, M. P. High-Efficiency Isolation of Nuclear Envelope Protein Complexes from Trypanosomes. The Nuclear Envelope. 1411, 67-80 (2016).
  29. Cristea, I. M., Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).
  30. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63-117 (2005).
  31. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321-349 (1964).
  32. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404-427 (1964).
  33. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  34. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  35. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624-637 (2011).
  36. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752-1756 (2005).
  37. Wang, X., Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46-57 (2008).
  38. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223-239 (2008).
  39. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861-879 (2010).
  40. Armean, I. M., Lilley, K. S., Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1-13 (2013).
  41. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. , (2013).
  42. Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE. 2005 (266), 1 (2005).
  43. Deppert, W. R., Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839 (1999).
  44. Ugwu, S. O., Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86-108 (2004).
  45. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603-617 (2009).
  46. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359-376 (2012).
  47. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Mole Bio. 424 (Chapter 1), 3-22 (2008).
  48. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285-303 (2009).
  49. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403-3408 (2015).
  50. Glatter, T., Ahrné, E., Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
  51. Zhao, Q. Q., Yamada, S., Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29-36 (1989).
  52. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B. 21 (7), 078201 (2012).
  53. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm?. Cell. 30 (2), 345 (1982).
  54. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
  55. Kalkum, M. . Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2, (2003).
  56. Staley, J. . Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. , (2005).
  57. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783-784 (2007).
  58. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093-581098 (2013).
  59. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif. 80 (2), 283-293 (2011).

Tags

Protein ComplexAffinity CaptureCryomilledMammalian CellsCell BiologyMolecular BiologyProtein InteractionsPBSCell PelletLiquid NitrogenCell Lysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
LaCava, J., Jiang, H., Rout, M. P. Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (118), e54518, doi:10.3791/54518 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image