البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled
Summary
نحن هنا وصف البروتوكولات لتعطيل خلايا الثدييات من قبل الطحن الحالة الصلبة في درجة حرارة المبردة، إنتاج استخراج الخلايا من مسحوق الخلية الناتجة عن ذلك، وعزل بروتين المجمعات الاهتمام من جانب القبض على تقارب على الخرز ممغطس يقترن الأجسام المضادة ميكرون الحجم.
Abstract
القبض على التقارب هو أسلوب فعال لعزل بروتين المجمعات الذاتية لمزيد من الدراسة. عندما تستخدم بالاقتران مع الأجسام المضادة، وأيضا كثيرا ما يشار إلى هذه التقنية كما مناعي. القبض على التقارب يمكن تطبيقها في نطاق مقاعد البدلاء وفي سياق الإنتاجية العالية. عندما يقترن مع مطياف الكتلة بروتين، وقد ثبت القبض على تقارب أن تكون العمود الفقري لتحليل interactome. على الرغم من أن هناك طرق العديد من المحتمل لتنفيذ الخطوات العديدة المعنية، البروتوكولات التالية تنفيذ الطرق المفضلة لدينا. اثنين من الميزات المميزة: استخدام مسحوق خلية cryomilled لإنتاج مقتطفات الخلية، والخرز ممغطس يقترن الأجسام المضادة كوسيلة تقارب. في كثير من الحالات، لقد حصلنا على نتائج متفوقة لتلك التي حصلت مع المزيد من الممارسات القبض على تقارب التقليدية. Cryomilling يتجنب العديد من المشاكل المرتبطة مع أشكال أخرى من الكسر الخلية. ويوفر الكسر الفعال للمادة، مع تجنب ديناتقضايا uration المرتبطة التدفئة أو الرغوة. فإنه يحتفظ البروتين الأصلي تركيز تصل إلى نقطة الاستخراج، والتخفيف من التفكك الجزيئات. أنه يقلل من الوقت البروتينات المستخرجة تنفق في حل، والحد من الأنشطة الإنزيمية الضارة، وأنه قد يقلل من امتصاص غير محدد من البروتينات عن طريق وسيلة تقارب. أصبحت وسائل الإعلام تقارب المغناطيسي ميكرون على نطاق أكثر شيوعا على مدى السنوات القليلة الماضية، لتحل محل متزايد agarose- التقليدية وسائل الإعلام على أساس سيفاروز. وتشمل المزايا الرئيسية لوسائط مغناطيسية أقل عادة امتصاص البروتين غير محددة. لا حدود حجم الاستبعاد بسبب بروتين معقد ملزمة يحدث على سطح حبة بدلا من داخل المسام. وسهولة التلاعب والتعامل مع استخدام المغناطيس.
Introduction
تطبيق نموذجي للإجراءات قدم هو لتحقيق الاستقرار والحصول على عائد مرتفع ونقاء مجمعات البروتين الذاتية من الفائدة لتوصيف interactomic 1. ومن المعلوم أن شبكات ديناميكية من كلا المجمعات الجزيئات المرتبطة مستقر وعابر، تتألف أساسا من البروتينات، تنسق العمليات الخلوية 2،3. في حين أن هناك العديد من الطرق التجريبية لتحديد تفاعلات البروتين البروتين، القبض على تقارب من بين الطرق الأكثر استخداما على نطاق واسع لعزل وتشريح مجمعات البروتين الفسيولوجية 4-6. وعلاوة على ذلك، فإن هذا الأسلوب له ميزة العائد المجمعات الجزيئات كما كيانات مادية، وليس مجرد نقاط البيانات في قراءة التدريجي؛ مفيد، وبالتالي يمكن استخدام المجمعات التي تم الحصول عليها في مجموعة من البيوكيميائية إضافية المصب، الأنزيمية، والمقايسات الهيكلية 7-9. تم تطوير البروتوكولات المعروضة في استجابة للحاجة إلى تعيين proteiشبكات التفاعل ن البروتين وتميز المجمعات الجزيئات في أدوارها كما الجزيئات المستجيب للبيولوجيا الخلية. وهي مفصلة فيما يتعلق تطبيقها على خلايا الثدييات نمت في زراعة الأنسجة، ولكن هل ينطبق أيضا على مجموعة واسعة من العينات البيولوجية نظرا بتعديل الخاصة بالنظام المناسبة.
تاريخ التقاط تقارب يمتد تاريخه إلى أوائل القرن العشرين مع أول التجارب immunoaffinity اللوني – تشبه ما يشار اليه عادة في هذه الأيام كما مناعي (IP) – تظهر في الكتابات عن 1950s في وقت مبكر. استخدام التيار تقنية تطويرها من خلال مطلع هذا القرن الحالي 10-13. وقد استخدمت الخلايا المتنوعة والدراسات البيولوجية الجزيئية الكسر الميكانيكية من الخلايا عن طريق طحن في درجات الحرارة المبردة على الأقل خلال الأربعين سنة الماضية 14-19. وفصل الجزيئات باستخدام (سوبر) الخرز ممغطس لها BECلى بعد شائعة بشكل متزايد على مدى العقدين الماضيين 20. الجمع بين هذه التقنيات المختلفة قد عملت على تحسين تآزر النتائج التي يمكن الحصول عليها في التجارب بروتين معقد القبض على تقارب 1، كما يتضح من مجموعة واسعة من العمل التي تنتجها أنفسنا والمجتمع توسيع نطاق البحث 7،9،11،18،19،21 -23. يتم عرض النتائج تدعم في الشكل 1.
مجموعة من المحاذير والاعتبارات التي تنطبق على تنفيذ التجارب فعالية التقاط تقارب يمكن العثور عليها في المرجع 1. عادة هذا النهج هو الأنسب ل: (I) فهرسة interactors من البروتين من الفائدة، أي استخدام البروتين مطياف الكتلة (MS) لتحديد البروتينات copurifying غير معروف حتى الآن (تحليل استكشافية)؛ (II) فحص لوجود شريك المتفاعل معين، أي استخدام MS أو لطخة غربية إلى الكشف عن بروتين معين أو مجموعة محدودة من البروتينات يشتبه فييتآثران interact فيؤديان مع البروتين من الفائدة (اختبار الفرضيات)؛ أو (الثالث) إعداد مجمعات البروتين تجميعها التطور الطبيعي الذي يحتوي على البروتين من الفائدة لمزيد من الدراسة من خلال تقنيات إضافية (workup إعدادي). قبل الشروع في نظام تجريبي القبض على تقارب فمن الضروري للغاية أن يكون هناك تقارب كاشف عالية الجودة التي تربط لبروتين الهدف، وعادة جسم مضاد-IP المختصة ضد البروتين الهدف الأصلي من مصلحة أو ضد علامة إلحاق البروتين الانصهار. ومن الأهمية بمكان أيضا أن أساليب مناسبة للقراءات تجريبية في مكان: تلطيخ بروتين العام (مثل Coomassie الأزرق، Sypro روبي، أو الفضة، بعد SDS-PAGE)، النشاف الغربي، والبروتين MS كلها تستخدم عادة بالتزامن مع القبض على تقارب 1. البروتوكولات المعروضة تستخدم الأجسام المضادة الخرز المغناطيسي مترافق باعتبارها وسيلة تقارب. في حين أن وظيفة من وسيلة تقارب يمكن في البداية يمكن التحقق من صحة في الاختبارات التي تستخدم بعض المعلمات التجريبية، لالحصول على أفضل النتائج كل تجربة يجب أن يكون الأمثل تجريبيا 1،11،24. يتم فصل البروتوكولات إلى ثلاث مراحل متميزة: (1) إعداد المواد الخلايا المجمدة. (2) الكسر الخلية عن طريق طحن الحالة الصلبة في درجة حرارة المبردة. و (3) استخراج البروتين والقبض على تقارب باستخدام الخرز ممغطس يقترن الأجسام المضادة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتعمل هذه البروتوكولات الثلاثة جنبا إلى جنب ل(1) إعداد الخلايا لكسر الحالة الصلبة التي cryomilling، (2) تحقيق الكسر في طاحونة الكرة الكواكب، و (3) تقديم مقتطفات من مسحوق الخلية إلى تقارب القبض على بروتين من الفائدة في مجمع مع interactors الفسيولوجية. وتوجد العديد من التقنيات خلية تحلل مختلفة، بما في ذلك النهج الميكانيكية / المادية توظيف سحق تأثير، القص، و / أو ضغط، وكذلك المواد الكيميائية / النهج الأنزيمية، ولكل منها إيجابيات وسلبيات 49،50 مختلفة. يشجع كل محقق لاستكشاف الطرق الأكثر ملائمة لتحليلاتهم، مع الأخذ في الاعتبار أن أي نهج المختار لكسر الخلايا واستخراج البروتين من المرجح أن يعرض التحيزات 51،52 يستلزم تحسين التجريبية (التي تناقش أدناه). طرق ميكانيكية قد تؤدي إلى ارتفاع الحرارة و / أو قوى القص التي يمكن أن تعطل مجمعات البروتين. Cryomilling يتجنب آثار التدفئة بحكم توظيف LN 2 تبريد عينات لرانه مدة العملية. فهم مطاحن الكرة الكواكب الاعتماد على قوات التأثير والاحتكاك، بما في ذلك إجهاد القص، ومكونات الجسيمات خفض حجم 53،54. في إعدادات ذكرت أننا لم احظ انحطاط مجمعات البروتين. في الواقع لدينا استخراج واسترجاع ما يبدو سليما ~ 50 نجمة داود الحمراء المجمعات المسام النووي 11 و إنزيمي retrotransposons نشط اظهار النشاط أعلى معين من التحضيرات توظيف "لطيف" القائم على المنظفات تحلل 7. الكيميائية الأساليب / الأنزيمية للتحلل الخلية تعاني من القيود التي يتم الافراج عن محتويات الخلية في المختبر في الوسط الذي يدعم تعطل أغشية الخلايا والجزيئات الهيكلية ولكن قد لا تكون مناسبة لصيانة سلامة المركب البروتيني (الخانات ) من اهتمام. في كثير من الأحيان، لا المكونة من المجمعات شكلت مع البروتين من الفائدة ولا الظروف اللازمة لتحقيق الاستقرار في المجمعات المستهدفة هيمعروفة مسبقا. وهناك فائدة كبيرة من الطحن الحالة الصلبة هي أن الكسر واستخراج وفكت، والسماح مصدر المواد لتكون مستعدة خالية من السائل وأضاف، تخزين (-80 درجة مئوية أو أقل)، جمعت، وسهولة استرجاعها لإجراء التجارب على الطلب. على سبيل المثال، لاستكشاف الأمثل في ظروف المختبر لالتقاط تقارب. تفاعلات البروتين هي الأكثر استقرارا في تركيز عال 55،56، وبالتالي التقليل من حجم مستخلصة يمكن أن يكون مفيدا للحفاظ على التفاعلات الفسيولوجية. من ناحية أخرى، هناك اعتبارات عملية – المجمعات البروتين لا بد من تقسيم للخروج من الخلايا وإلى المرحلة المائية غير لزجة، وخالية من الركام غير قابلة للذوبان، وذلك لتختلط المجمعات الهدف مع متوسط النسب. وعلاوة على ذلك، هناك حاجة إلى بعض التقييس والسيطرة على البيئة في المختبر (درجة الحموضة، تركيز الملح، الخ) لتنظيم والتكاثر. نجد أن يستخرج العلاقات العامةoduced في نطاق التخفيف من 1: 4-1: 9 (ث: •) تلبية الاهتمامات العملية والنظرية، مما أسفر عن نتائج جيدة. بالإضافة إلى ذلك، فإن نسبة المثلى لاستخراج الخلايا إلى تقارب احتياجات المتوسطة يحدد لاحقا. ويتم ذلك تجريبيا عن طريق المعايرة مقتطفات مع كميات متفاوتة من متوسطة تقارب ويمكن أن يكون لها آثار للكشف على نسبة من التجربة إشارة إلى الضجيج، لمزيد من المناقشة أدناه. استنزاف ممتازا للبروتين الهدف هو عادة ≥70٪ من نسبة ذوبان البروتين الهدف، ولكن> 90٪ أمر مرغوب فيه ويمكن أن يكون قابلا للتحقيق مع المعايير والثوابت دقيق للظروف الاستخراج. وتغطي العديد من هذه الاعتبارات العملية في إشارة 1. يتم التلاعب الخرز ممغطس باستخدام مغناطيس النيوديميوم في حامل أنبوب microcentrifuge المتخصصة، على الرغم من أن بدائل محلية الصنع قادرة على البقاء. عند وضعها داخل حامل، وحبات تتجمع في جانب من أنبوب تحت تأثير الحقل المغناطيسي للأرض. ومن ثم يمكن إزالة الحلول دون ديsturbing الخرز.
واحد الحد من بروتوكول cryomilling المقدمة، وضعت مع طاحونة الكرة الكواكب المستخدمة هنا (انظر جدول المواد)، غير أن الحد الأدنى من المواد مطلوب بشكل فعال مطحنة واستعادة مسحوق الخلية باستخدام هذا الجهاز (> 1 غرام). يتم الحصول على هذه الكميات بسهولة مع العديد من الميكروبات، خطوط الخلايا والكائنات الحية النموذج، ويمكن أيضا في كثير من الأحيان أن يتحقق مع الأنسجة استئصاله من الحيوانات المختبرية. ومع ذلك، قد تكون بعض خطوط الخلايا من الصعب جدا أن ينمو في الأنسجة وفرة والحيوان قد تكون نادرة. كميات أقل من المواد يمكن المضروب نسبيا باستخدام أجهزة أخرى تستخدم حاويات أصغر، على الرغم من أن يحتمل في التضحية من صفاء مسحوق تحقيقه. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تكلفة أجهزة الطحن الميكانيكية قد تكون باهظة التكاليف لبعض المختبرات. Cryomilling يمكن تحقيق ذلك باستخدام عدد من الاجهزة البديلة 14-19، بما في ذلك أكثر كلفة معقولة من ناحية استخدام آفةلو وقذائف هاون، على الرغم من كفاءة الكسر قطرات إلى حد كبير. بروتوكولات القبض على التقارب تهدف عادة لكفاءة عالية من تحلل الخلية لتسهيل استخراج أقصى البروتين إلى حل، وبالتالي، إمكانية القصوى للقبض على المجمعات البروتين المستهدف. من ناحية أخرى، فقد ثبت للخميرة في الربط المختبر مقتطفات أن تحلل القصوى قد لا يتساوى مع القصوى في النشاط الكيميائي الحيوي المختبر 57،58. لم نلحظ مثل هذه المشاكل في النظم اختبرناها حتى الآن، وبالتالي لا تحد هادف لدينا الكسر الخلية عندما cryomilling. ومع ذلك، ينبغي أن يؤخذ هذا الاحتمال في الاعتبار عند تحسين لفحوصات في المختبر الأنزيمية. على الرغم من أن cryomilling هي طريقة فعالة للغاية لكسر الخلايا، كمية محدودة من صوتنة غالبا ما يعود بالنفع على إنتاج متجانسة مقتطفات خلية كاملة من أنسجة الثدييات بسبب المجاميع غير متجانسة يمكن في بعض الأحيان أن يلاحظ بالفحص البصري: عادةفي ظروف عملية الاستخلاص باستخدام منخفضة إلى معتدلة الملح (100-300 ملم) والمنظفات غير الأيونية (0،1-1٪ ت / ت) تركيزات. لأننا لوحظ أن وجود هذه المجاميع يمكن أن تقلل من المحصول و/ أو نوعية القبض على تقارب لاحق، علينا أن ننفذ بشكل روتيني صوتنة لتفريقهم (حتى عندما لا تراعى أنها بالعين المجردة). المجاميع تتفق مع شظايا غشاء متكتل، مماثلة لتلك التي ذكرت سابقا في مقتطفات من خلايا الخميرة المضروب 58. يستخدم صوتنة أيضا في بعض البروتوكولات ليجز الحمض النووي وتحرير أجزاء لونين إلى حل، ولكن درجة صوتنة المطبقة في هذا البروتوكول لا ملحوظ تفتيت الحمض النووي. محدودية (أو تكلفة عالية) ليجند تقارب ممتاز أو الأجسام المضادة ضد بروتين معين من الاهتمام قد يكون عائقا آخر. وهناك مجموعة واسعة من الكواشف تقارب المتاحة تجاريا من الممكن زيادته عند الكائن الحي نموذج هو قابل للعلامات الجينوم أو آرansfection مع ناقلات التعبير خارج الرحم، والسماح للتعبير عن البروتينات التي تهم واندماج الموسومة تقارب. ومع ذلك، أصبح إنتاج الأجسام المضادة مخصصة ممكنا على نحو متزايد ويمكن لكل من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة وأداء ممتاز في التطبيقات القبض على تقارب. وتغطي هذه الاعتبارات كثيرة أيضا بمزيد من التفصيل في إشارة 1.
ويوضح أمثلة لكيفية طريقة خلية تحلل واختيار المتوسطة تقارب يمكن أن تؤثر على النتائج في الشكل 1. ويمكن رؤية أمثلة على الآثار التي كتبها extractants المختلفة المبذولة في المراجع 1،11،24. لأن هذه وغيرها من المعالم التجريبية تؤثر على جودة التقاط تقارب، مما يجعل من الصعب التمييز ضباط الإتصال، مستودعات لل"proteomes حبة" والنهج الحسابية للقضاء وضعت الملوثات غير محددة للمساعدة في تحديد ضباط الإتصال 40-43. ومع ذلك، هذه النهج فقط substitيوت لإعداد نموذج الأمثل لدرجة محدودة 59. مراقبة أفضل الممارسات وتحسين تجريبيا سوف التقاط تجربة تقارب توفير أعلى جودة عينات لتحليل المصب، وناقش بالتفصيل أدناه. ممارسة تنفيذها بسهولة التي يمكن أن تحسن نقاء العينة شطف الأصلي. في أغلب الأحيان يستخدم شطف الأصلي للحصول على تقارب معزول بروتين معقد، سليمة، لمزيد من التجارب. ولكن كما هو في كثير من الأحيان يعزز نقاء العينة، فإنه يمكن أن تستخدم أيضا لهذا السبب وحده. ومع ذلك، كما هو موضح في الشكل رقم 1، لوحة الثاني، قدرة شطف الأصلي لتحسين نقاء العينة قد تعتمد على معايرة دقيقة لكمية متوسطة تقارب وفرة من البروتين المستهدف في استخراج الخلايا – عندما المتوسطة في زيادة ، paratopes غير مأهولة قد تسمح تراكم بعيدا عن الهدف من البروتينات FP يمكن ملاحظتها في كسور مزال أصلا. باستخدام الكواشف والإجراءات الموضحة هنا، فإنه حكما كانت تجربتنا أن أكبر مساهم منفرد من ضباط الإتصال لتجاربنا هو البروتين الموسومة نفسه إزالة مرة واحدة من سياق الخلية الحية. (الشكل 1.II والشكل S1). في مثل هذه الحالات، الأبوية الضوابط خط الخلية التي تحقق proteomes غير ذات صلة في حالة عدم وجود مستضد لا قيمة عملية؛ كذلك لعناصر العلامة فقط أو ارتفاع في أن تخلو من أي شيء ولكن المستضد الهدف. لذلك، كلما كان ذلك عمليا ننفذ I-الترابية 7،38، والذي يقيس مباشرة تراكم بروتين تفاعلات ما بعد تحلل باستخدام MS الكمية. كما ذكر في الخطوة 3.2.7 من البروتوكول، وإجراءات لشطف الأصلي تختلف مع تفاصيل النظام تقارب المستخدمة. ويتحقق شطف الأصلي الأكثر شيوعا من النزوح تنافسية من البروتين الموسومة انشقاق معقدة أو بروتين من العلامة، والإفراج عن مجمع من وسيلة تقارب. العديد من أنظمة تقارب تتألف من علامات حاتمة صغيرة موجودة، فوص الذي حاتمة نفسها هي متوفرة كما الببتيد مفيدة لشطف التنافسي للمجمعات البروتين الموسومة 60. وبالمثل، تتوفر ليلتصق على وجه التحديد المواقع المشابهة موقع استراتيجي في تقارب عدة البروتياز الموسومة البروتينات الانصهار 61. تبعا لخصوصيات النظم تقارب المختار، قد اعتمد خطة شطف المناسب.
عموما، ونوعية النتائج التي تم الحصول عليها سوف تتأثر بشكل كبير من خلال نوعية من إعداد العينة. من المهم أن تعمل بعناية وبدقة من خلال كل خطوة من هذه البروتوكولات، وبأسرع وقت ممكن مع الحفاظ على بعناية ودقة. فإنه من المستحسن أن تتبع التقسيم من البروتين من الفائدة من خلال كل خطوة لفهم كفاءة كل تلاعب. على سبيل المثال: كيف وفيرة هي بروتين من الفائدة في الخلايا او الانسجة في السؤال؟ ولعل بروتين قيد الدراسة (والمجمعات الخاصة به) سيكون تحديا للتميز من قبل كتلةمطياف يرجع إلى وفرة منخفضة. إذا المجمعات النقاء قابلة للكشف من قبل تلطيخ بروتين العام (حوالي نانوجرام المدى)، ومن المرجح أن تنجح مطياف الكتلة. إذا كان من الممكن الكشف عن البروتين القبض على المصالح فقط من حساسية تعزيز النشاف الغربي chemiluminescent (ما يقرب من مجموعة بيكو غرام)، هو أقل احتمالا أن تكون فعالة مطياف الكتلة. حتى لو كان البروتين من الفائدة وفرة في الخلية، كيف وفيرة هو عليه في استخراج الخلايا المنتجة؟ هل تقسيم البروتين إلى حل أم أنها في بيليه؟ إذا كان هذا الأخير، وهو حل استخراج الجديد يمكن وضع قد تحسن الانتعاش. مرة واحدة يتم الجمع بين استخراج الخلايا مع وسيلة تقارب، مدى فعالية يتم التقاط البروتين؟ لا تزال بروتين ملزمة من خلال يغسل اللاحقة؟ ماذا عن البروتينات copurifying أخرى؟ عن طريق توفير قسامة من كل عينة في الخطوات المناسبة للبروتوكول هذه الأسئلة يمكن بسهولة أن يجيب، وعادة من قبل النشاف الغربي ضد بروتين من الفائدةأو تلطيخ بروتين العام، ولكن فحوصات أخرى قد تكون مناسبة أيضا. وتحسين كل خطوة تعزيز المحصول ونقاء المجمعات القبض عليه، رغم أنه قد يكون هناك مفاضلة ليتم في تعظيم سمة واحدة أو أخرى.
تطبيق نموذجي من القبض على تقارب لكثير من الباحثين في تحديد المرشح في interactors الجسم الحي لعدد قليل من البروتينات في المصالح؛ ويتعرض هؤلاء المرشحين عادة إلى التحقق من النهج المتعامدة في الجسم الحي للتدليل على الأهمية البيولوجية للinteractors المادية. ويعمل القبض على التقارب أيضا دراسات الإنتاجية العالية لتوليد قوائم copurifying البروتينات لوحظ على أساس (تقريبا) واسعة بروتيوم، تسهيل الاستدلالات الحسابية المتعلقة المفترضة في المجمعات الجسم الحي. يمكن العثور على العديد من الأمثلة على هذه الدراسات في الأدب. هذا النهج تحرم تعظيم الاستفادة من ظروف اعتقال لأي هدف معين لصالح استكشاف الرجلأهداف ذ. على هذا النحو، والمجمعات الاستدلال نادرا ما يتم استرداد أنفسهم سليمة تماما ونقية للغاية في أي عينة معينة. وبدلا من ذلك، يتم استخدام التداخل الجزئي في التراكيب لوحظ بين العديد من العينات الملتقطة تقارب متميزة كأساس للالاستدلالات 42. كلا النهجين تساهم بيانات قيمة لفهمنا للinteractome. ومع ذلك، فائدة كبيرة واحدة من القبض على تقارب هو أنه لا وكثيرا ما تتيح الفرصة للحصول على المجمعات المقدمة سليمة وتنقيته للغاية، أن تبذل الجهود لتحسين العملية. ونحن نعتقد أن مستقبل النهج يكمن في زيادة سهولة وكفاءة الاستفادة المثلى من القبض على مجمعات البروتين الذاتية 11، لتقييم أكثر دقة من سلسلة من interactors الفسيولوجية واستخدام أكثر تواترا في مزيد من البيوكيميائية المصب، enzymological، والدراسات الهيكلية، على سبيل المثال، تشير 7،9،23.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الأستاذ براين T. Chait لله لا يقدر بثمن المشورة والدعم والوصول إلى MS الأجهزة، وكذلك السيدة كيلي ر مولوي حصول على الدعم الفني الممتاز. نشكر السيدة كيلي باري لدعم مع تحرير نسخة. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة المعاهد الوطنية للصحة P41GM109824، P41GM103314، وP50GM107632.
Materials
| Growth media & cell culturing implements | For producing frozen cells (I) | ||
| 500 cm^2 culture dishes | Corning | 431110 | For producing frozen cells (I) |
| Large beaker (1-2L) | For producing frozen cells (I) | ||
| Rectangular ice pan | Fisher Scientific | 13-900-747 | For producing frozen cells (I), & cryomilling (II) |
| Phosphate buffered saline (PBS) | For producing frozen cells (I) | ||
| Large cell scrapers | Fisher Scientific | 08-100-242 | For producing frozen cells (I) |
| Liquid nitrogen | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
| 50 ml conical tubes | Corning | 352098 | For producing frozen cells (I), & cryomilling (II) |
| 20 ml Luer lock syringe | For producing frozen cells (I) | ||
| Leur lock syringe caps | www.dymax.com | T11182 | For producing frozen cells (I) |
| Refrigerated centrifuge | For producing frozen cells (I) | ||
| 50 ml tube rack, 4 position | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
| Styrofoam box | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
| Planetary ball mill, PM 100 | Retsch | 20.540.0001 | For cryomilling (II) |
| Stainless steel milling jar, 50 ml | Retsch | 01.462.0149 | For cryomilling (II) |
| Stainless steel milling balls, 20 mm Ø | Retsch | 05.368.0062 | For cryomilling (II) |
| Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm | www.marcorubber.com | T1044-2.62×44.63 | For cryomilling (II) |
| mini-LN2 decanter | homemade | see Ref 19 | For cryomilling (II) |
| 250 ml PTFE jar insulator (optional) | Retsch | custom order | For cryomilling (II) |
| PTFE puck insulator (optional) | homemade | The Rockefeller University | For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request. |
| 5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional) | http://www.leeimh.com/ | 558 series check valve | For cryomilling (II) |
| 1.5 – 2 ml microfuge tubes | For affinity capture (III) | ||
| Extractant | For affinity capture (III) | ||
| cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Applied Science | 11873580001 | For affinity capture (III) |
| Vortex mixer | For affinity capture (III) | ||
| Ice bucket | For affinity capture (III) | ||
| Microtip sonicator, Q700 | Qsonica | Q700 | For affinity capture (III) |
| low intensity 1/16” microtip probe | Qsonica | 4717 | For affinity capture (III) |
| Bench-top refrigerated microcentrifuge | For affinity capture (III) | ||
| Dynabeads M-270 Epoxy | Thermo Fisher | 14302D | For affinity capture (III) |
| Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads | homemade | For affinity capture (III); see reference 19 | |
| Sample rotator | For affinity capture (III) | ||
| Neodymium magnet | Life Technologies | 123-21D | For affinity capture (III) |
| SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) | For affinity capture (III) | ||
| DTT | For affinity capture (III) | ||
| SDS-PAGE system | For affinity capture (III) | ||
| SDS-polyacrylamide gel | For affinity capture (III) | ||
| Protein Stain | For affinity capture (III) |
References
- LaCava, J., Molloy, K. R., Taylor, M. S., Domanski, M., Chait, B. T., Rout, M. P. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: Pointers, pitfalls, preferences and perspectives. BioTechniques. 58 (3), 103-119 (2015).
- Devos, D., Russell, R. B. A more complete, complexed and structured interactome. Curr Opin Struct Biol. 17 (3), 370-377 (2007).
- Aitchison, J. D., Rout, M. P. The interactome challenge. J Cell Biol. 211 (4), 729-732 (2015).
- Nie, Y., Viola, C., et al. Getting a grip on complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Bonetta, L. Protein-protein interactions: Interactome under construction. Nature. 468 (7325), (2010).
- Perkel, J. M. Protein-Protein Interaction Technologies Toward a Human Interactome. Science. 329 (5990), 463-465 (2010).
- Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Affinity Proteomics Reveals Human Host Factors Implicated in Discrete Stages of LINE-1 Retrotransposition. Cell. 155 (5), 1034-1048 (2013).
- Liu, J. -. J., Bratkowski, M. A., Liu, X., Niu, C. -. Y., Ke, A., Wang, H. -. W. Visualization of distinct substrate-recruitment pathways in the yeast exosome by EM. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 95-102 (2014).
- Shi, Y., Pellarin, R., et al. A strategy for dissecting the architectures of native macromolecular assemblies. Nat Methods. 12 (12), 1135-1138 (2015).
- Roque, A. C. A., Lowe, C. R. Affinity chromatography: History, perspectives, limitations and prospects. Methods in Molecular Biology. 421 (1), 1-21 (2007).
- Hakhverdyan, Z., Domanski, M., et al. Rapid, optimized interactomic screening. Nat Methods. 12 (6), 553-560 (2015).
- Huttlin, E. L., Ting, L., et al. The BioPlex Network: A Systematic Exploration of the Human Interactome. Cell. 162 (2), 425-440 (2015).
- Hein, M. Y., Hubner, N. C., et al. A Human Interactome in Three Quantitative Dimensions Organized by Stoichiometries and Abundances. Cell. 163 (3), 712-723 (2015).
- Smucker, R. A., Pfister, R. M. Liquid nitrogen cryo-impacting: a new concept for cell disruption. Appl Microbiol. 30 (3), 445-449 (1975).
- Schultz, M. C., Choe, S. Y., Reeder, R. H. Specific initiation by RNA polymerase I in a whole-cell extract from yeast. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (3), 1004-1008 (1991).
- Schultz, M., Hockman, D., Harkness, T., Garinther, W., Altheim, B. Chromatin assembly in a yeast whole-cell extract. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (17), 9034-9039 (1997).
- Stevens, S. W., Abelson, J. Yeast pre-mRNA splicing: Methods, mechanisms, and machinery. Method Enzymol. 351, 200-220 (2002).
- Oeffinger, M., Wei, K. E., et al. Comprehensive analysis of diverse ribonucleoprotein complexes. Nat Methods. 4 (11), 951-956 (2007).
- Domanski, M., Molloy, K., et al. Improved methodology for the affinity isolation of human protein complexes expressed at near endogenous levels. BioTechniques. , 1-6 (2012).
- Sinclair, B. To bead or not to bead: Applications of magnetic bead technology. Scientist. , (1998).
- Cristea, I., Williams, R., Chait, B., Rout, M. Fluorescent proteins as proteomic probes. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 1933-1941 (2005).
- Di Virgilio, M., Callen, E., et al. Rif1 prevents resection of DNA breaks and promotes immunoglobulin class switching. Science. 339 (6120), 711-715 (2013).
- Heider, M. R., Gu, M., et al. Subunit connectivity, assembly determinants and architecture of the yeast exocyst complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (1), 59-66 (2016).
- LaCava, J., Fernandez-Martinez, J., Hakhverdyan, Z., Rout, M. P. Protein Complex Purification by Affinity Capture. Budding Yeast: A Laboratory Manual. 2016 (21), 383-397 (2016).
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells. , (2011).
- Uphoff, C. C., Drexler, H. G. . Basic Cell Culture Protocols. 946, (2013).
- Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Characterization of L1-Ribonucleoprotein Particles. Transposons and Retrotransposons. 1400 (Chapter 20), 311-338 (2016).
- Obado, S. O., Field, M. C., Chait, B. T., Rout, M. P. High-Efficiency Isolation of Nuclear Envelope Protein Complexes from Trypanosomes. The Nuclear Envelope. 1411, 67-80 (2016).
- Cristea, I. M., Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).
- Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63-117 (2005).
- Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321-349 (1964).
- Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404-427 (1964).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624-637 (2011).
- Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752-1756 (2005).
- Wang, X., Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46-57 (2008).
- Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223-239 (2008).
- Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861-879 (2010).
- Armean, I. M., Lilley, K. S., Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1-13 (2013).
- Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. , (2013).
- Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE. 2005 (266), 1 (2005).
- Deppert, W. R., Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839 (1999).
- Ugwu, S. O., Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86-108 (2004).
- Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603-617 (2009).
- Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359-376 (2012).
- Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Mole Bio. 424 (Chapter 1), 3-22 (2008).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285-303 (2009).
- Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403-3408 (2015).
- Glatter, T., Ahrné, E., Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
- Zhao, Q. Q., Yamada, S., Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29-36 (1989).
- Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B. 21 (7), 078201 (2012).
- Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm?. Cell. 30 (2), 345 (1982).
- Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
- Kalkum, M. . Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2, (2003).
- Staley, J. . Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. , (2005).
- Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783-784 (2007).
- Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093-581098 (2013).
- Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif. 80 (2), 283-293 (2011).
