פיתוח בינוני אגר chromogenic רגיש וספציפי יותר לצורך זיהוי של<em> Parahaemolyticus Vibrio</em> ו אחר<em> Vibrio</em> מינים
Summary
Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.
Abstract
זיהומי foodborne בארה"ב נגרמת על ידי מיני Vibrio הראו מגמת עלייה. בשנת מהמין Vibrio, parahaemolyticus V. אחראי רוב דלקות -associated Vibrio. לפיכך, בידול מדויק בין spp Vibrio. וזיהוי של V. parahaemolyticus יש חשיבות קריטית כדי להבטיח את שלומם של אספקת המזון שלנו. למרות בטכניקות מולקולריות נפוצות יותר ויותר, שיטות-תלוי תרבות עדיין נעשות באופן שיגרתי והם נחשבים שיטות סטנדרטיות בנסיבות מסוימות. לפיכך, מדיום אגר chromogenic רומן נבדק במטרה לספק שיטה טובה יותר עבור בידוד ובידול של spp Vibrio משמעות קלינית. הפרוטוקול משווה את הרגישות, סגולי וזיהוי הגבול לצורך זיהוי של V. parahaemolyticus בין מדיום chromogenic החדש מדיום קונבנציונלי. V. השונה זני parahaemolyticus (n = 22) מחדשהצגת קפסיד ומקור מגוונים של מקורות ששמשו. הם זוהו בעבר על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC), ומאומת נוספת במעבדה שלנו על ידי tlh -PCR. לפחות ארבעה ניסויים נפרדים, זנים אלה היו מחוסנים על מלחי סוכרוז chromogenic אגר thiosulfate-ציטראט-מרה (TCBS) אגר, המהווה את המדיום המומלץ culturing מין זה, ואחריו דגירה על 35-37 מעלות צלזיוס למשך 24 hr -96. שלושה V. זני parahaemolyticus (13.6%) לא גדלו באופן אופטימלי על TCBS, בכל זאת הציגו מושבות ירוקות אם יש צמיחה. שני זנים (9.1%) לא הניב המושבות ציאן הצפויות על אגר chromogenic. V. אי זני parahaemolyticus (n = 32) נבדקו גם כדי לקבוע את הספציפיות של אגר chromogenic. בין זנים אלה, 31 לא גדלו ולא הפגינו שום מורפולוגיה מושבה אחרות. ההתאוששות הממוצעת של V. parahaemolyticus על chromogenic אגר היה ~ 96.4% ביחס ל אגר סויה tryptic בתוספת 2% NaCl. לסיכום, אגר chromogenic החדש הוא מדיום יעיל לגילוי V. parahaemolyticus וכדי להבחין בינו vibrios האחר.
Introduction
כחבר של סוג Vibrio, V. parahaemolyticus הוא גראם שלילי, שאינם יוצרי נבגים, מעוקל, חיידק דמוי מוט. הוא מציג תנועתיות גבוהה בשתי סביבות נוזלות חצי מוצק. רוב V. זני parahaemolyticus הם פתוגניים לבני אדם, אך תת פתוגניים גרמו מגיפות מגפות, ומכאן מין זה נחשב פתוגן foodborne חשוב במדינות רבות 1,2. השכיחות של זיהום Vibrio בארה"ב הוכיחה מגמת עלייה מאז 2000 3. בין spp Vibrio., V. parahaemolyticus הוא המין הנפוץ ביותר בגרימת מחלות בארצות הברית 4,5. מינים אחרים רלוונטיים קליני כוללים V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae ועוד אחוז קטן של המחלות נגרם על ידי מינים רבים בו זמנית.
Parahaemolyticus V. הוא i טבעיnhabitant מים ימיים ולכן התפוצה הרחבה ביותר במי אוקיינוס ברחבי העולם כולל שפכי נהרות. המין התגלה בשנת 1950 לאחר התפרצות של הרעלת מזון ביפן. בארה"ב, המין בודד לראשונה במי ים, משקעים, סרטנים וצדפות באזור Puget Sound 6,7. ניזונים מסנן בבתי גידול ימי, כגון צדפות צדפה, עשויים להכיל סוגי V. parahaemolyticus כחלק פלורה 8 הטבעית שלהם. ככזה, V. זיהומים parahaemolyticus ב האנושי לעיתים קרובות קשור לצריכה של פירות ים מזוהמים, במיוחד צדפות נא או שלא בושל. מסלול משותף פחות כניסה מתרחש כאשר פצע פתוח חשוף מי ים, מוביל לזיהום עור. רוב V. זני parahaemolyticus אינם גורם למחל אדם, אך תת מסוימים מחסה גורמים ארסיים כמו המוליזין ישיר thermostable (TDH) הם פתוגניים. התסמינים הנפוצים ביותר של V. foodborne parahaemolyticus זיהום הנושלשולים וכאבי בטן, ואחריו בחילות, הקאות וחום. כאבי ראש וצמרמורות גם מדווחות. תקופת הדגירה החציוני הוא 15 שעות, אבל יכול להיות עד 96 שעות לאחר צריכת כמות מספקת של זנים פתוגניים 9. המחלה נמשכת בין יומיים לשלושה ימים. הסימפטומים גסטרואנטריטיס הנגרמת על ידי V. parahaemolyticus הם בעיקר מעצמם ולכן טיפול מיוחד אין צורך. מקרים קלים של גסטרואנטריטיס ניתן לטפל ביעילות על ידי למקרה של התייבשות. עוד מחלות קשות ניתן לטפל על ידי אנטיביוטיקה כגון טטרציקלין או ציפרופלוקסצין 10. שיעור תמותה הוא כ -2% למקרי גסטרו, אך הוא עשוי להיות גבוה ככל 29% למי לפתח זיהום או הרעלת דם דם. כל אדם אשר צורכת פירות ים או יש פצע פתוח חשופים מי ים נמצא בסיכון של V. זיהום parahaemolyticus. הצורה חמורה יותר של מחלות, הרעלת דם מסכני חיים, נפוצה יותר בתוך תת-אוכלוסייה עם שיתוף רפואי בסיסיnditions 11, הכולל אלכוהוליזם, מחלות כבדות, סוכרת, מחלת כליות, ממאירות, ומצבים אחרים מובילים לתגובה חיסונית מוחלשת. יש לציין, קבוצה זו של אנשים היא גם בסיכון גבוה יותר לחלות במחלות קשות שנגרם על ידי V. vulnificus, אשר ניתן למצוא בבתי גידול טבעי דומה V. parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus מבודדת באופן שגרתי באמצעות thiosulfate-ציטראט מרה מלחי סוכרוז (TCBS) אגר כמדיום סלקטיבית ההפרש. עשרה במי peptone אלקליין עלולים להקדים בידוד על אגר TCBS. מושבות משוערות על TCBS אז נבדקים נוספים מערך של בדיקות ביוכימיות / או מבחנים מולקולריים מיקוד הנוכחות של גנים ספציפי מינים. בשיטות מבוססות PCR משמשים לעתים קרובות כדי לאשר את זהותם של V. parahaemolyticus ידי הגברת גן המוליזין thermolabile, tlh 12.
לא משנה של chOICE של שיטות אישור, חשוב שיהיה מדיום יעיל לבודד ולהבחין V. parahaemolyticus מ vibrios הימי אחר מלכתחילה. TCBS נעשה שימוש בדרך כלל להבדיל מינים בתוך הסוג Vibrio לפי היכולות שלהם כדי להתסיס סוכרוז 12. תגובת תסיסה חיובית מלווה בשינוי בצבע הכחול Bromothymol אינדיקטור pH. V. מושבות parahaemolyticus הן די מובחנות TCBS, מפגין כחול לצבע ירוק. עם זאת, המדיום הזה לא יכול בקלות להבחין V. alginolyticus ו V. cholerae. תסיסת סוכרוז מינים פרוטאוס עשויים לייצר מושבות צהובות דומות V. cholerae או V. alginolyticus 13. על בידוד ראשוני על TCBS, V. parahaemolyticus יכול להיות גם בטעות כמפר Aeromonas hydrophila, shigelloides Plesiomonas, ו Pseudomonas spp 14. זנים עם Ferm סוכרוז מתעכבentation עלול להתבלבל עם סוכרוז אחר nonfermenting 13 Vibrio, הכולל V. parahaemolyticus. TCBS נמצאה להיות רגישים לא נגד Escherichia coli, putrefaciens Pseudomonas, בין היתר. מינים אחרים כמה להניב ירוק מושבות אפורות אשר מבולבלות פוטנציאלי עם V. parahaemolyticus או V. vulnificus 15. כתוצאה מכך, רצוי לפתח תקשורת תרבות האלטרנטיבית ברגישות טובה יותר וספציפי כלפי גילוי ובידוד V. parahaemolyticus ומינים אחרים קשורים זה לזה.
חלופות מדיה פותחו מספר לאחרונה. בנוסף להכללת סוכנים סלקטיבית, רוב לשלב מצעים chromogenic להבדיל מבוסס מינים על פעילות אנזימטית ההפרש שלהם. לדוגמה, indoxyl-β-glucoside ו indoxyl-β-galactoside שימשו מצעים chromogenic להבדיל V. פסקתימושבות haemolyticus (אשר מופיעים בצבע ירוק כחלחל) מאלו של V. cholerae (סגול) בשל היכולות ההפרש שלהם לייצר-glucosidase β ו β-galactosidase 16. ניסוחים שונים של אגר chromogenic שפותחו על ידי מספר קבוצות הוערכו ו דווחו לבצע דומה ל- או יותר טוב 17,18,19 TCBS. יתרון של שימוש בינוני chromogenic הוא כי והצביעה סביב המדיום היא מינימאלית ובכך מקלות על הבידוד של מושבות בפרט. במחקר זה, החוקרים העריכו את היכולת של מדיום chromogenic שעוצבה זה מקרוב כדי לזהות ולבודד V. cholerae, V. parahaemolyticus, ו V. vulnificus; עם דגש מיוחד על יכולתה להבחין V. parahaemolyticus ממינים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה מתמקד בפיתוח התקשורת והתרבות והערכה. כמקובל, TCBS היא סלקטיבית ובינוניים ההפרש המשמש לבידוד ואיתור V. parahaemolyticus, V. cholerae ו V. vulnificus 12. עם זאת, מגבלות דווחו על המדיום הזה, כגון אי היכולת להבדיל V. cholerae ממיני Vibrio אחרים. סוכרוז אינדיקטור pH הם סוכ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מ Channey, א צ'או, ו ק תומס על עזרתם על הפרויקט. אספקה הפרויקט מומנו חלקית על ידי אוניברסיטת מדינת הפוליטכני בקליפורניה.
Materials
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | ||
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisherii | 环境科学 | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
References
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J., Faruque, S. M. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. , 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food – Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- . Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008 Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008)
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States – major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. . Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- MacFaddin, J. F. . Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -. C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
