تطوير أكثر حساسية وخصوصية اللونية آجار المتوسطة للكشف عن<em> الضمة نظيرة الحالة للدم</em> وغيره<em> الضمة</em> الأنواع
Summary
Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.
Abstract
وقد أظهرت العدوى تنتقل عن طريق الأغذية في الولايات المتحدة التي تسببها أنواع الضمة اتجاها تصاعديا. في جنس الضمة، V. نظيرة الحالة للدم هو المسؤول عن غالبية الإصابات -associated الضمة. وهكذا، والتفريق الدقيق بين الضمة النيابة. وكشف V. نظيرة الحالة للدم هو في غاية الأهمية لضمان سلامة الإمدادات الغذائية لدينا. على الرغم من أن التقنيات الجزيئية شائعة على نحو متزايد، لا تزال تفعل أساليب اعتمادا الثقافة بشكل روتيني وأنها تعتبر الأساليب القياسية في ظروف معينة. وبالتالي، تم اختبار رواية المتوسطة أجار مولد اللون مع الهدف المتمثل في توفير أفضل طريقة لعزل والتفريق بين النيابة الضمة ذات الصلة سريريا. مقارنة بروتوكول الحد الحساسية والنوعية والكشف للكشف عن V. نظيرة الحالة للدم بين المتوسطة مولد اللون الجديد والمتوسطة التقليدية. خامسا مختلف سلالات نظيرة الحالة للدم (ن = 22) إعادةعرض الأنماط المصلية ومصدر من أصول مختلفة استخدمت. كانوا تحديدها من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) ومراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC)، وكذلك التحقق في مختبرنا من قبل TLH -PCR. في أربعة على الأقل محاكمات منفصلة، تم تلقيح هذه السلالات على اللونية أجار ووحمض-سترات الصفراء أملاح-السكروز (TCBS) أجار، التي هي وسيلة الموصى بها لزراعة هذا النوع، تليها الحضانة في 35-37 درجة مئوية لمدة 24 -96 ساعة. ثلاثة V. لم سلالات نظيرة الحالة للدم (13.6٪) لا ينمو بالشكل الأمثل على TCBS، ومع ذلك أظهرت مستعمرات خضراء إذا كان هناك نمو. لم سلالتين (9.1٪) لم تسفر المستعمرات السماوي المتوقعة على أجار مولد اللون. خامسا عدم تم اختبار سلالات نظيرة الحالة للدم (ن = 32) أيضا لتحديد خصوصية أجار مولد اللون. ومن بين هذه السلالات، لم لا تنمو 31 أو عرضت الأشكال التضاريسية مستعمرة أخرى. يعني استرداد V. نظيرة الحالة للدم على chromogeكانت شركة الاستثمارات الوطنية أجار ~ 96.4٪ بالمقارنة مع أجار الصويا زيتية تستكمل مع 2٪ كلوريد الصوديوم. في الختام، أجار مولد اللون الجديد هو وسيلة فعالة للكشف عن V. نظيرة الحالة للدم ولتمييزه عن ضمات أخرى.
Introduction
كعضو من جنس الضمة، V. نظيرة الحالة للدم هو، المنحني، على شكل قضيب البكتيريا سالبة الجرام، وتشكيل غير بوغ. فإنه يسلك حركية عالية في كل من البيئات السائلة وشبه الصلبة. معظم V. سلالات نظيرة الحالة للدم هي غير الممرضة للإنسان، ومع ذلك فقد الأنواع الفرعية الممرضة تسبب الأوبئة والجوائح، وبالتالي يعتبر هذا النوع أن يكون الممرض تنتقل عن طريق الأغذية في العديد من البلدان 1،2. وقد أظهرت حدوث العدوى الضمة في الولايات المتحدة اتجاها تصاعديا منذ عام 2000 3. ومن بين الضمة النيابة.، V. نظيرة الحالة للدم هو النوع الأكثر ذكرت في كثير من الأحيان تسبب الأمراض في الولايات المتحدة 4،5. وتشمل الأنواع الأخرى ذات الصلة سريريا خامسا alginolyticus، V. vulnificus، V. الكوليرا، وما يحدث هناك نسبة صغيرة من الأمراض عن طريق أنواع متعددة في وقت واحد.
خامسا نظيرة الحالة للدم هو ط الطبيعيnhabitant من المياه البحرية، وبالتالي توزيعها على نطاق واسع في المياه البحرية في جميع أنحاء العالم بما في ذلك مصبات الأنهار. تم اكتشاف الأنواع في عام 1950 بعد تفشي التسمم الغذائي في اليابان. في الولايات المتحدة، والأنواع عزله للمرة الأولى في مياه البحر والرواسب، والمحار في المنطقة بوجيه ساوند 6،7. مرشح مغذيات في الموائل البحرية مثل المحار الصدفتين، يمكن أن تأوي V. نظيرة الحالة للدم كجزء من النباتات الطبيعية 8. على هذا النحو، V. وغالبا ما ترتبط العدوى نظيرة الحالة للدم في الانسان الى استهلاك الأغذية البحرية الملوثة، وخاصة المحار النيئ أو. يحدث الطريق أقل شيوعا من دخول عندما يتعرض الجرح مفتوحا لمياه البحر، مما يؤدي إلى إصابة الجلد. معظم V. سلالات نظيرة الحالة للدم لا تسبب الأمراض التي تصيب البشر، ولكن بعض الأنواع الفرعية إيواء عوامل الفوعة مثل دموية بالحرارة مباشرة (TDH) والمسببة للأمراض. الأعراض الأكثر شيوعا من الأمراض المنقولة بالغذاء V. عدوى نظيرة الحالة للدم همالاسهال وآلام في البطن، تليها الغثيان والقيء، والحمى. كما تم الإبلاغ عن الصداع والقشعريرة. فترة الحضانة متوسط هو 15 ساعة، ولكن يمكن أن تصل إلى 96 ساعة بعد استهلاك كمية كافية من السلالات المسببة للأمراض 9. يستمر المرض من سنتين إلى ثلاث أيام. أعراض التهاب المعدة والأمعاء الناجمة عن V. نظيرة الحالة للدم وإلى حد كبير محدودة ذاتيا والعلاج وبالتالي الخاصة ليست ضرورية. الحالات الخفيفة من التهاب المعدة والأمعاء ويمكن علاجها على نحو فعال من خلال معالجة الجفاف عن طريق الفم. ويمكن علاج أمراض خطيرة أكثر من المضادات الحيوية مثل التتراسيكلين أو سيبروفلوكساسين 10. معدل وفيات حوالي 2٪ للحالات التهاب المعدة والأمعاء، ولكن قد يصل إلى 29٪ لأولئك الذين يطورون عدوى مجرى الدم أو تسمم الدم. أي الشخص الذي يستهلك المأكولات البحرية أو لديه جرح مفتوح تتعرض لمياه البحر في خطر من V. عدوى نظيرة الحالة للدم. شكل أكثر شدة من الأمراض، وتسمم الدم تهدد الحياة، هو أكثر شيوعا في جزء من السكان مع زملاء الطبي الأساسيnditions 11، والتي تشمل إدمان الكحول، وأمراض الكبد، ومرض السكري، وأمراض الكلى والأورام الخبيثة، وغيرها من الشروط التي تؤدي إلى استجابة مناعية ضعيفة. والجدير بالذكر أن هذه المجموعة من الأفراد هي أيضا في خطر أعلى للتعاقد الأمراض الحادة الناجمة عن V. vulnificus، التي يمكن العثور عليها في الموائل الطبيعية مشابهة لV. نظيرة الحالة للدم.
يتم عزل خامسا نظيرة الحالة للدم بشكل روتيني باستخدام وحمض-سترات الصفراء أملاح-السكروز (TCBS) أجار كوسيلة انتقائية والتفاضلية. تخصيب اليورانيوم في البيبتون القلوية قد تسبق العزلة على TCBS أجار. وثم مزيد من الاختبارات المستعمرات الظني على TCBS في سلسلة من الاختبارات البيوكيميائية و / أو المقايسات الجزيئية التي تستهدف وجود جينات الأنواع المحددة. وغالبا ما تستخدم أساليب PCR القائم لتأكيد هوية V. نظيرة الحالة للدم عن طريق تضخيم الجين دموية بالحرارة، TLH 12.
بغض النظر عن الفصلOICE أساليب تأكيد، فمن المهم أن يكون وسيلة فعالة لعزل وتمييز V. نظيرة الحالة للدم من ضمات البحرية الأخرى في المقام الأول. وقد استخدمت بشكل روتيني TCBS للتمييز الأنواع داخل جنس الضمة وفقا لقدراتهم للتخمر السكروز 12. ويرافق رد فعل إيجابي التخمير عن تغيير لون مؤشر الرقم الهيدروجيني زرقة البروموثيمول. ف. المستعمرات نظيرة الحالة للدم هي مميزة إلى حد ما على TCBS، واظهار اللون الأزرق إلى اللون الأخضر. ومع ذلك، هذه الوسيلة لا يمكن التفريق بسهولة V. alginolyticus والخامس. الكوليرا. الأنواع بروتيوس-تخمر السكروز قد ينتج مستعمرات صفراء تشبه V. الكوليرا أو V. alginolyticus 13. على العزلة الأولية على TCBS، V. ويمكن أيضا أن أخطأ في التعرف نظيرة الحالة للدم كما الإيروموناس هايدروفيلا، القوربية الشيغيلانية، وأنواع الزائفة 14. سلالات مع سعر الصرف الثابت السكروز تأخرقد يتم الخلط بين entation مع السكروز الآخرين nonfermenting الضمة 13، والتي تشمل V. نظيرة الحالة للدم. تم العثور على TCBS أن تكون ليست حساسة ضد كولاي، الجرية الزائفة، من بين أمور أخرى. تسفر عن العديد من الأنواع الأخرى خضراء إلى رمادية المستعمرات التي يحتمل الخلط بينه وبين V. نظيرة الحالة للدم أو V. vulnificus 15. ونتيجة لذلك، فمن المستحسن لتطوير وسائل الإعلام ثقافة بديلة مع أفضل حساسية وخصوصية نحو كشف وعزل خامسا نظيرة الحالة للدم وغيرها من الأنواع ذات صلة وثيقة.
وقد وضعت مؤخرا عدة بدائل وسائل الإعلام. بالإضافة إلى إدراج وكلاء انتقائية، فإن معظم إدماج ركائز اللونية للتمييز الأنواع على أساس الأنشطة الإنزيمية التفاضلية الخاصة بهم. على سبيل المثال، استخدمت الإندوكسيل-β-جلوكوسيدي والإندوكسيل-β-غالاكتوزيد باعتبارها ركائز اللونية للتمييز V. الفقرةالمستعمرات لدم (والتي تظهر لون أخضر مزرق) من تلك التي V. الكوليرا (الأرجواني) بسبب قدراته التفاضلي على إنتاج بيتا جلوكوزيد وβ غالاكتوزيداز 16. تم تقييم تركيبات مختلفة من أجار مولدات اللون وضعت من قبل العديد من الجماعات ووذكرت لأداء نسبيا أو أفضل من TCBS 17،18،19. ميزة استخدام وسيلة مولد اللون هو أن التلوين من الوسط المحيط هو الحد الأدنى مما يسهل عزل المستعمرات معينة. في هذه الدراسة، قمنا بتقييم قدرة متوسطة مولد اللون وضعت حديثا لكشف وعزل خامسا الكوليرا، V. نظيرة الحالة للدم، والخامس vulnificus. مع التركيز بشكل خاص على قدرته على التفريق V. نظيرة الحالة للدم من الأنواع الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتركز هذه الدراسة على تطوير وسائل الإعلام والثقافة، والتقييم. تقليديا، TCBS هو انتقائية والتفضيلية تستخدم سيلة لعزل وكشف V. نظيرة الحالة للدم، ضمة الكوليرا والخامس. vulnificus 12. ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن القيود لهذه الوسيلة، مثل عدم القدرة على التفريق V. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر السيد Channey، E. تشاو، و ك توماس لما قدموه من مساعدة في هذا المشروع. وقد تم تمويل وازم المشروع جزئيا من قبل جامعة ولاية كاليفورنيا بوليتكنيك.
Materials
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | ||
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisherii | 环境科学 | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
References
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J., Faruque, S. M. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. , 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food – Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- . Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008 Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008)
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States – major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. . Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- MacFaddin, J. F. . Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -. C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
